納他霉素處理對鮮切雙孢菇褐變的抑制機理

徐冬穎，顧思彤，周福慧，陳 晨，姜愛麗*，胡文忠*

（大連民族大學生命科學學院，生物技術與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600）

雙孢菇（Agaricus bisporus）屬傘菌科蘑菇屬，俗稱口蘑、白蘑菇，占世界食用菌總量的32%[1]。雙孢菇富含VB3、煙酸、葉酸、礦物元素等營養成分，具有獨特的風味和口感及清除自由基的抗氧化活性[2-3]，深受消費者青睞。由于雙孢菇具有易失水、呼吸速率和代謝活性較高等特性[4-5]，加之沒有外皮保護其免受物理傷害或微生物浸染；因此，采后易發生由酶促酚類化合物氧化所引起的褐變[6-7]，常溫下貨架期通常只有1～3 d[8]。隨著消費者“方便食用同營養兼具”新觀念的形成，鮮切產品在近幾十年來迅速發展[9]。但鮮切加工過程中的去皮、切割等操作會破壞組織的完整性，擾亂菇子實體正常的生理代謝[10]，造成傷脅迫，加劇褐變的發生。

納他霉素是由納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natelensis）產生的天然抗真菌劑，是一種天然防腐劑，通過抑制真菌細胞膜甾醇類物質的合成，增強膜的通透性，使細胞膜溶解從而起到防腐的作用[11]。與其他化學防腐劑相比，納他霉素具有無潛在過敏性及高效等特點[12]，是一種安全無毒的防腐劑，美國農業部將其列為一般公認安全（編號：GRAS 21CFR 172.155, FDA-ASP/1577,007681-93-8），歐盟也將其列為天然防腐劑行列（編號：EEC No.235）[11]。抗壞血酸是一種天然抗氧化劑，具有清除自由基、促進氧化金屬離子螯合等作用[13]。D-異抗壞血酸鈉是抗壞血酸的衍生物，它們具有相同的抗氧化能力，可將醌類物質及其衍生物還原為酚類，防止黑色素的形成[14]。本研究采用納他霉素、納他霉素與D-異抗壞血酸鈉復配處理鮮切雙孢菇，旨在篩選出抑制鮮切雙孢菇褐變的最佳處理方法，解析其抗褐變機理，為鮮切雙孢菇的保鮮貯藏提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雙孢菇購于遼寧省岫巖滿族自治縣嘉韻食用菌種植專業社，采后立即低溫運至實驗室，選取大小、形狀適中，沒有開傘，無機械損傷和病蟲害的新鮮雙孢菇作為實驗材料。

聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、愈創木酚、過氧化氫、苯丙氨酸等 天津市科密歐化學試劑有限公司；羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）和還原性谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）含量試劑盒 蘇州科銘生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

GC-2010型氣相色譜儀 日本島津公司；TA.XT Plus型質構儀 英國Stable Micro Systems公司；酶標儀 美國Thermo Scientific公司；UV-9200紫外-可見分光光度計北京瑞利分析儀器有限公司；CR400/CR410色差計日本Konica Minolta公司；DJS-1C型電導率儀上海精密科學儀器有限公司；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；AL240電子精密天平 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將實驗涉及的菜刀、菜板和塑料托盤等工具在體積分數為2%的次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，取出后用蒸餾水沖洗2～3 次，瀝干，將雙孢菇子實體按照縱線切成1 cm厚的切片，隨機平均分為3 組，分別立即用0.1 g/kg的納他霉素溶液（將1 g納他霉素、1 g乙二胺四乙酸溶于10 L去離子水中，攪拌均勻）、復合試劑（0.1 g/kg納他霉素＋10 g/kgD-異抗壞血酸鈉）、去離子水（對照）浸泡處理5 min。將樣品瀝干后放入塑料托盤中，使用家用聚乙烯保鮮膜包裝，于4 ℃下貯藏，分別在第0、3、6、9、12天測定相關指標。

1.3.2 色澤、硬度的測定

使用色差計在雙孢菇中軸線部位測定L值、a值和b值，每個處理重復測定10 次。褐變指數（browning index，BI）參照Palou等[15]的方法并按照公式（1）、（2）進行計算。ΔE表示與理想雙孢菇的色澤（L＝97、a＝－2、b＝0）相比，整體色澤的變化程度，用公式（3）[16]進行計算。

使用配備有直徑為5 mm圓柱形探頭的TA.XT Plus型質構儀，以1 mm/s的下壓速率測定鮮切雙孢菇的硬度，單位為g。

1.3.3 霉菌和酵母總數的測定

霉菌和酵母總數的檢測方法參考GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》[17]。其中對照和各處理0 d的數據是在雙孢菇晾干2 h后測得的。

1.3.4 質量損失率的測定

質量損失率采用公式（4）進行計算。

式中：m0表示樣品的初始質量/g；m表示取樣時的質量/g。

1.3.5 呼吸強度、相對電導率的測定

呼吸強度的測定參照姜愛麗等[18]的方法，以每小時每千克雙孢菇產生CO2的體積計，單位為mL/（kg·h）。

相對電導率的測定：每組處理隨機取10 片鮮切雙孢菇切碎混合后，取1.0 g樣品，加入90 mL去離子水，煮沸25 min，用電導率儀分別測定常溫下（E/（μS/cm））和煮沸后（E0/（μS/cm））的電導率，用公式（5）計算相對電導率[19]。

1.3.6 VC、總酚、GSH、HYP含量的測定

VC含量采用2,6-二氯酚靛酚滴定法測定，單位為mg/100 g。

總酚含量的測定采用Pirie等[20]的方法并稍作修改，取1.0 g樣品，加入5 mL預冷的體積分數1%鹽酸-甲醇溶液，于4 ℃、13 000×g離心20 min，測定其在280 nm波長處的吸光度。樣品定量采用外標法[21]，以沒食子酸（gallic acid，GA）為標準品，總酚含量用每克果蔬組織相當于GA的物質的量表示，單位為mmol/g。

GSH含量的測定采用Wang Bin等[22]的方法并加以修改。取5.0 g樣品，加入5.0 mL 50 g/L三氯乙酸溶液，于4 ℃、12 000×g離心10 min，收集上清液。參照GSH含量試劑盒的說明書進行操作，基于2-硝基苯甲酸與GSH反應時生成黃色產物，在反應10 min后，于412 nm波長處測定顯色液的吸光度。

HYP含量的測定參照HYP含量試劑盒說明書方法。

1.3.7 相關酶活力的測定

過氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力測定參照Wang Qing等[23]的方法。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力測定參照Han Cong等[24]的方法。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）和多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的測定參照姜愛麗等[18]的方法。酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）活力的測定參照Zou Yu等[25]的方法。

1.3.8 抗氧化能力的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率和羥自由基清除率的測定參照Wang Lei等[26]的方法。總抗氧化能力的測定參照Duarte-Sierra等[27]的方法。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 不同處理對鮮切雙孢菇色澤、質地及微生物指標的影響

表1 不同處理對鮮切雙孢菇色澤、質地及微生物指標的影響Table 1 Effects of different treatments on color, texture and microbial indicators of fresh-cut Agaricus bisporus

L值表示亮度，其值越大說明色澤越亮，由表1可知，樣品的L值在貯藏期間不斷下降，其中，納他霉素和復合試劑處理組的L值始終高于對照組，且差異顯著（P＜0.05），但復合試劑處理對L值降低的抑制效果最顯著。ΔE值表示雙孢菇的色澤變化程度（褐變程度）。3 個處理組的ΔE值和BI在貯藏期間的變化趨勢完全一致，均隨著貯藏時間的延長而逐漸上升，但復合試劑處理組在整個貯藏期間ΔE值和BI均顯著低于納他霉素處理和對照組（P＜0.05）。與對照組相比，納他霉素處理也可有效抑制ΔE值和BI的上升，且在貯藏6 d后二者差異顯著（P＜0.05）。

硬度是代表果蔬質構的重要物理指標，隨著貯藏時間的延長和呼吸消耗的加劇，果蔬的質地會變得疏松，導致硬度下降。如表1所示，所有樣品的硬度在貯藏期間呈下降趨勢，但復合試劑處理組雙孢菇的硬度在整個貯藏期間均顯著高于對照和納他霉素處理組（P＜0.05）。

對照組的霉菌和酵母總數在1 2 d時高達7.05（lg（CFU/g）），比納他霉素和復合試劑處理高3～4 個數量級，其中，復合試劑處理更有利于降低鮮切雙孢菇的霉菌和酵母總數。

2.2 不同處理對鮮切雙孢菇生理品質和抗氧化物質含量的影響

蒸騰失水和呼吸消耗是果蔬貯藏過程中質量損失和新鮮度下降的主要原因。雙孢菇經過鮮切加工后，失水面積增加，呼吸代謝加速，導致貯藏過程中質量損失率和呼吸強度均呈上升趨勢（表2），但與對照和納他霉素處理組相比，復合試劑處理組質量損失率和呼吸強度始終顯著更低。貯藏結束時（12 d），對照組的呼吸強度高達140.29 mL/（kg·h），比復合試劑處理組高38.1%。

表2 不同處理對鮮切雙孢菇質量損失率、呼吸強度、相對電導率和VC、總酚、GSH、HYP含量的影響Table 2 Effects of different treatments on mass loss rate, respiration intensity, relative electrical conductivity, and vitamin C, total phenols,GSH and hydroxyproline contents in fresh-cut Agaricus bisporus

切割會導致雙孢菇細胞膜破損，使細胞內容物外滲，電導率增加。所有處理組在貯藏期間的相對電導率均呈上升趨勢，但復合試劑處理的相對電導率顯著低于同期的其他兩組（P＜0.05）。

植物體內存在著重要的抗氧化系統——VC-GSH循環系統，可與其他活性氧清除系統協同作用，清除植物體內過多的自由基[30]。VC和還原型GSH均為果蔬體內重要的非酶抗氧化物質，GSH可將脫氫抗壞血酸還原成VC，而VC具有直接清除H2O2的作用，同時提高細胞抗氧化系統的還原勢。貯藏過程中各處理組的VC和GSH含量均呈下降趨勢（表2），復合試劑處理組在貯藏期間的VC和GSH含量顯著高于對照和納他霉素處理組（P＜0.05），貯藏結束時（12 d），這兩種物質含量分別為對照組的1.30 倍和1.27 倍。

總酚是一種重要的抗氧化物質，其中多酚是多酚氧化反應中的底物，參與褐變反應[20]。由表2可知，總酚含量的變化趨勢與VC和GSH基本相似，均呈持續下降，但復合試劑處理組鮮切雙孢菇總酚含量下降的速度較慢，并在3 d和6 d時顯著高于其他兩組（P＜0.05）。HYP不僅是一種抗氧化物質，也是一種膠原氨基酸，對膠原蛋白的形成有重要影響[31]，而膠原蛋白則影響雙孢菇的質地和感官性狀。3 組雙孢菇的HYP含量在貯藏期間呈先上升后下降趨勢（表2），在第6天時達到峰值，其中復合試劑處理組的HYP含量在貯藏過程中顯著高于其他兩組（P＜0.05）。

2.3 不同處理對鮮切雙孢菇抗氧化相關酶活力的影響

圖1 不同處理對鮮切雙孢菇CAT（A）、SOD（B）、PAL（C）和GR（D）活力的影響Fig. 1 Effects of different treatments on CAT (A), SOD (B), PAL (C)and GR (D) activities in fresh-cut Agaricus bisporus

作為自由基清除系統重要的工具酶，CAT的作用機理與VC的抗氧化作用機理相似，都是通過分解H2O2來抑制H2O2對組織造成的氧化損傷[23]。如圖1A所示，所有處理在貯藏期間CAT活力均呈下降趨勢，其中納他霉素和復合試劑處理組在6 d后CAT活力顯著高于對照組（P＜0.05），復合試劑處理更有利于維持CAT活力，從而清除組織中的H2O2，減輕自由基引起的氧化損傷，進而抑制鮮切雙孢菇的褐變程度。

SOD可將超氧陰離子分解為H2O2，CAT將H2O2分解為水和氧氣，從而降低氧化損傷[24]。3 個處理組的SOD活力在貯藏過程中均呈先上升后下降趨勢（圖1B），3 d時SOD活力均達到峰值，且復合試劑處理組的SOD活力顯著高于其余兩組（P＜0.05），而在貯藏的第9天和12天，兩種納他霉素處理組的SOD活力均顯著高于對照組（P＜0.05），但兩個處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

PAL是植物苯丙烷代謝重要的工具酶，影響植物抗病性的產生，在植物的生長發育過程中起重要作用[18]。如圖1C所示，3 個處理組的PAL活力在貯藏期間呈先迅速上升后趨于平緩的趨勢，3 d時對照組、納他霉素和復合試劑處理組的PAL活力分別是0 d時的2.24、2.44 倍和2.57 倍，說明切割處理有效誘導了PAL活性。在第3、9 天和12 天時兩種納他霉素處理組的PAL活力均顯著高于對照組（P＜0.05），且復合試劑處理更有利于PAL活力的保持。

GR是一種利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)將氧化型谷胱甘肽催化反應成GSH的酶，在VC-GSH循環系統中起到重要的氧化應激作用[23]。圖1D結果表明，復合試劑處理最有利于鮮切雙孢菇在貯藏期間GR活力的保持，表現為3、9 d和12 d時GR活力顯著高于對照組和納他霉素處理組（P＜0.05），說明D-異抗壞血酸鈉的添加是鮮切雙孢菇保持較高GR活力的原因所在。

2.4 不同處理對鮮切雙孢菇褐變相關酶活力的影響

圖2 不同處理對鮮切雙孢菇PPO（A）和TYR（B）活力的影響Fig. 2 Effects of different treatments on PPO (A) and TYR (B)activities in fresh-cut Agaricus bisporus

褐變是雙孢菇采后商品性迅速下降的主要原因，引起雙孢菇褐變的酶主要有PPO和TYR，其中PPO是以雙酚為底物將其催化形成褐色的醌類物質，而TYR是一種具有雙重功能的酶，TYR先催化單酚的羥基化反應形成雙酚，再將雙酚氧化形成左旋多巴和黑色素等有生物活性的物質[5,25]，雙孢菇子實體內TYR結構與人體內的非常相似，因此，雙孢菇被認為是重要的營養功效性食物。黑色素的形成也是雙孢菇在受到環境脅迫時的一個自我保護機制[5]。PPO和TYR活力在貯藏過程中的變化趨勢如圖2A、B所示，二者均呈整體上升趨勢，其中復合試劑處理最有利于抑制PPO和TYR活力的上升，表現為貯藏期內該處理的PPO和TYR活力始終顯著低于其他兩組（P＜0.05）。

2.5 不同處理對鮮切雙孢菇抗氧化能力的影響

圖3 不同處理對鮮切雙孢菇DPPH自由基清除率（A）、羥自由基清除率（B）和總抗氧化能力（C）的影響Fig. 3 Effects of different treatments on DPPH (A), hydroxyl (B)radical scavenging rate, and total antioxidant capacity (C) of fresh-cut Agaricus bisporus

雙孢菇采后衰老是一個復雜的生理生化過程，與活性氧的代謝平衡密切相關。自由基是植物代謝過程中的毒副產品，可引起生物大分子物質的氧化損傷，自由基積累會使組織細胞膜損傷，引起代謝紊亂[32]。DPPH是一種穩定的自由基，已被廣泛用于測定抗氧化劑清除自由基的能力，羥自由基具有極強的氧化能力，是生物組織中最具活性的自由基[33-34]。植物在成熟衰老的過程中會產生大量的活性氧，細胞中的活性氧自由基清除系統能通過清除過多的活性氧自由基來維持膜的穩定性和完整性[35]。總抗氧化能力是機體所有物質的抗氧化能力的總和，可作為評價果蔬采后品質的重要指標。

表3 各生理指標的相關性Table 3 Correlation of physiological indexes

如圖3所示，貯藏期間3 個處理組鮮切雙孢菇的DPPH自由基清除能力、羥自由基清除率和總抗氧化能力均呈下降趨勢，其中以DPPH自由基清除能力下降的速度最為緩慢（圖3A），貯藏結束時（12 d），對照組、納他霉素和復合試劑處理組的DPPH自由基清除率分別為80.8%、84.5%和87.5%，比0 d分別降低了15.2%、11.3%和8.1%，而羥自由基清除率下降的速度最快（圖3B），貯藏12 d時，對照組、納他霉素和復合試劑處理組的羥自由基清除率僅為0 d時的6.9%、7.1%和13.6%。在第9天時，復合試劑處理組的總抗氧化能力比對照組提高了46.7%（圖3D）。

2.6 不同處理對鮮切雙孢菇生理代謝影響的PCA和Pearson相關性分析

PCA是現代多元數據分析的標準工具，可將原來眾多具有一定相關性的數據重新組成一組新的互相無關的綜合指標，從而來代替原來的指標用于綜合分析[29]。由圖4A可知，主成分1的貢獻率為80.362%，主成分2的貢獻率為6.582%，兩個主成分解釋了86.944%的總方差，因此雙孢菇中檢測的20 個指標可由兩個主成分來表示，其中主成分1與L值、硬度、VC含量、總抗氧化能力呈高度正相關，與BI、ΔE、相對電導率、質量損失率、PPO活力呈高度負相關，主成分2與GR活力呈高度正相關，與HYP、PAL活力呈高度負相關，因此，兩個主成分可以綜合表現雙孢菇品質。以主成分1為橫軸，主成分2為縱軸建立坐標系，橫軸數值越大表示樣品抗氧化能力越強，反之則表示樣品品質越差，縱軸數值越大表示樣品品質越好。由圖4B可看出，CK-0樣品的橫軸和縱軸數值皆最大，表明第0天樣品品質最好，隨著橫軸及縱軸數值的減小，各樣品品質逐漸下降，總體來看，樣品品質排序為復合試劑處理組＞單獨納他霉素處理＞對照。

圖4 不同處理對鮮切雙孢菇各生理指標的主成分載荷（A）和得分（B）的影響Fig. 4 Principal component loading (A) and comprehensive scores plots (B)for physiological indexes of fresh-cut Agaricus bisporus with different treatments

由表3可知，雙孢菇品質相關的20 個指標相互間大部分呈極顯著相關（P＜0.01），其中BI與L值、硬度及抗氧化物質（GSH和VC）含量呈極顯著負相關（P＜0.01），與質量損失率、呼吸速率及相對電導率呈極顯著正相關（P＜0.01）。此外，PPO和TYR活力與BI之間存在著極顯著正相關關系（P＜0.01），說明鮮切雙孢菇的褐變主要是由PPO和TYR活力上升引起的。PPO和TYR活力升高導致鮮切雙孢菇產生褐變是把雙刃劍，一方面降低了鮮切產品的商品性；另一方面是雙孢菇對切割傷害的自我保護，尤其是TYR催化產生的左旋多巴和黑色素等是對人體具有重要作用的營養素。DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、總抗氧化能力與相對電導率、PPO活力、TYR活力均呈極顯著負相關（P＜0.01），而與抗氧化酶（SOD、CAT）活力呈極顯著正相關（P＜0.01）。表明雙孢菇采后貯藏期間過多的活性氧自由基加速了組織的脂質氧化，對細胞膜造成了損傷，導致酶和底物隔離分布減弱，從而誘導菇子實體褐變，而納他霉素和復合試劑處理組可通過提高清除自由基能力來增強機體的抗氧化能力。上述分析表明雙孢菇的呼吸代謝、抗氧化物質含量、抗氧化能力與雙孢菇品質密切相關。

3 討 論

由酚酶催化和自動氧化引發的褐變是雙孢菇品質劣變的主要原因[25]。為此，研究者曾從多方面入手尋求解決或緩解褐變問題的方法，如采前在灌溉液中加入氯化鈣可增加采收時雙孢菇的白度并減輕采后褐變的發生[36]，納他霉素＋純氧復合處理能延緩褐變和帽裂，減少酵母菌和霉菌的微生物數量[37]，使用H2O2沖洗＋異抗壞血酸鈉溶液噴灑模擬工藝生產線可減輕采后雙孢菇褐斑損傷[38]。納他霉素作為一種高效、安全的新型生物保鮮劑，可有效抑制綠蘆筍等多種果蔬的酵母菌和霉菌總數及褐變[39]，D-異抗壞血酸鈉是一種綠色、安全、有效的食品添加劑，能有效防止鮮切蘋果及鮮切蓮藕等果蔬褐變現象的發生[40-41]，但這兩種試劑在鮮切蘑菇褐變方面應用較少，特別是對菇子實體抗褐變的機理研究更是鮮有報道。

活性氧的積累會引起膜脂過氧化，導致細胞破裂，致使PPO與酚類物質接觸，使雙孢菇產生褐變現象[42]，Kukura等[43]認為細胞膜完整性的保持可抑制TYR與底物的結合，從而降低菇子實體的褐變程度。本研究發現，雙孢菇的BI與相對電導率、PPO活力、TYR活力呈極顯著正相關（P＜0.01），與總酚含量、抗氧化酶（CAT、SOD、PAL、GR）活力、自由基清除力及總抗氧化能力呈極顯著負相關（P＜0.01），推測雙孢菇采后鮮切貯藏過程中產生過多的活性氧自由基會對組織細胞膜造成損傷，導致酶和底物接觸，從而誘導雙孢菇子實體褐變；而細胞的抗氧化系統能清除過多的活性氧自由基來維持膜的穩定性和完整性，對褐變起到一定的抑制作用。這一結論與水楊酸處理后的雙孢菇通過提高抗氧化系統活性和酚類物質的積累來延緩菇子實體褐變[44]一致。

本實驗結果表明，納他霉素及復合處理能降低雙孢菇的褐變程度，維持采后鮮切品質，其機制可能是抑制了菇子實體酵母和霉菌總數、PPO和TYR活力的上升及抗氧化能力的下降。因此，納他霉素和D-異抗壞血酸鈉可作為安全高效的食品添加劑用于鮮切雙孢菇的貯藏保鮮。