魚類內臟蛋白的開發和應用研究進展

鄭子懿，李 琳*，蘇 丹，李光輝

（電子科技大學中山學院，廣東 中山 528402）

全球人均魚肉消費量已從1960年的9.9 kg升至2014年的20.1 kg[1]。與此同時，在鮮魚加工過程中產生了大量的副產物，包括內臟、魚頭、魚骨、魚鱗、魚皮等。根據魚的種類不同，這些副產物的總質量可占鮮魚總質量的50%～70%[1]。據統計，這些副產物中50%左右被直接丟棄，僅有30%被初步加工為低值的動物飼料、肥料或發酵魚露[2]。魚類加工副產物若得不到妥善處理，極易污染土壤和水源[3]。另一方面，企業往往忽視了魚類加工副產物潛在價值的開發。魚類加工副產物通常含有膠原蛋白、糖胺聚糖、多不飽和脂肪酸、磷脂、維生素、酶、活性肽等多種生物活性物質[4]。這些成分決定魚類加工副產物有著極大的精深加工潛力。對此類副產品進行有目的的加工，不僅能夠提升加工單元的額外收益，也能夠避免因直接丟棄而引發的環境污染。

魚內臟一般可占整魚質量的7.5%～15.0%[5]。魚內臟蛋白類物質的質量可達內臟干質量的20%以上，其所占比例與魚種類、年齡、季節、飼料及其他因素有直接關系[6]。本文涉及到的魚內臟蛋白類物質的加工產品有5 類，分別為生物活性肽、細菌素、生物降解膜、蛋白胨和內臟酶。本文將逐一對上述產品的加工技術及其產品功能特性的研究進展、成果進行綜述，并展望魚類內臟蛋白類物質的未來研究方向和發展趨勢。

1 魚內臟源生物活性肽的制備工藝和功能特性

1.1 魚內臟源生物活性肽的制備工藝

通過酸堿法水解或酶法水解將魚內臟蛋白轉化為低分子質量肽或游離氨基酸，是提高魚內臟蛋白生物活性的常見方法[7]。在酸堿水解或酶解之前，需要進行一系列的預處理工藝。若預處理工藝不當，蛋白溶液極易發生氧化、變色甚至產生惡臭味和有毒物質[8]。預處理手段通常包括破碎、擠壓、熱處理、脫脂、過濾、均質等一系列操作單元。熱處理的目的是將魚內臟酶類滅活，若需用魚內臟內源蛋白酶進行自水解，則可不進行熱處理這一預處理工藝[2,9-10]。

用酸或堿水解魚內臟蛋白已被廣泛研究[11-12]。酸堿水解法最主要的優勢是成本低，因此在工業中的應用較為廣泛。然而在酸堿水解過程中，必需氨基酸如色氨酸、蛋氨酸、胱氨酸和半胱氨酸容易被破壞，導致氨基酸損失[13]。此外，從產品角度來說，因需要對酸或堿液進行中和，所以所得蛋白水解液含鹽量通常較高。因此，采用酸堿法制備活性肽需要后續的納米過濾、離子交換樹脂等方法除鹽[14]。

與酸堿水解法不同，通過酶解法獲得魚內臟蛋白酶解液的反應條件通常較為溫和，且具有品質可控、副產物少等優點[15]。因此近年來，越來越多的學者采用酶法水解魚內臟蛋白制備活性肽。在酶解工藝中，因不同種類的蛋白酶對切割位點具有選擇性，所以蛋白酶種類的選擇極其重要。綜合文獻來看，在魚內臟蛋白酶解工藝中常用的商用蛋白酶有堿性蛋白酶、風味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等[15-16]。顯然，蛋白酶的高價格是制約酶解法制備魚內臟蛋白酶解液在工業生產中應用的主要因素。出于降低成本的考慮，部分研究者們利用魚類內源蛋白酶系水解內臟蛋白[17]。

在酸堿水解或酶解步驟之后，為了去除水解液中未完全水解的、不具有生物活性的蛋白質或其他物質，通常會采用離心、鹽析、微孔過濾、納米膜過濾、超濾等手段處理酶解液[18-19]。之后，根據肽理化性質的不同，采用親和層析、凝膠層析、疏水層析、纖維素層析、離子交換層析、分子排阻色譜、高效液相色譜、毛細管電泳中的一種或幾種方法組合的方式，對生物活性肽進行靶向分離純化[19-20]。魚內臟蛋白水解制備活性肽的工藝流程如圖1所示。后續如需對肽的氨基酸序列進行鑒定，常采用質譜分析，如連續流快原子轟擊質譜、電噴霧離子質譜、基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜等[21-23]。此外，核磁共振法也可用于氨基酸個數小于30的肽的氨基酸序列分析[24]。

圖1 魚內臟蛋白水解制備活性肽的工藝流程Fig. 1 Flow chart for preparation of bioactive peptides by hydrolysis of fish viscera

1.2 魚內臟源生物活性肽的生理活性

關于魚內臟蛋白水解物中肽的生理活性的研究較多。國內方面，李致瑜等通過Alcalase蛋白酶酶解大黃魚內臟蛋白制備抗氧化肽，發現肽的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為85.97%，羥自由基清除率為75.79[25]。楊曉軍等以斑點叉尾鮰內臟為原料，經木瓜蛋白酶酶解后得到血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制率為72.34%的活性肽[26]。國外方面，Kumar等用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶水解馬鮫魚內臟蛋白，之后采用離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離得到一種抗氧化肽，并用電噴霧串聯質譜測定出氨基酸序列為Ala-Cys-Phe-Leu。這種抗氧化肽在0.2 mg/mL下對羥自由基和DPPH自由基的清除率分別可達59.1%和89.2%[27]。與此相似，Ganesh等用胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶水解烏鯧內臟蛋白，鑒定出一種氨基酸序列為Ala-Met-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala的抗氧化肽，發現其具有抗DNA氧化損傷的作用[16]。Bougatef等利用沙丁魚內臟自身蛋白酶系來酶解內臟蛋白，并從中分離并鑒定出一種ACE抑制肽，但未測定其氨基酸序列[28]。Motamedzadegan等采用中性蛋白酶來改善黃鰭金槍魚內臟酶系酶解內臟蛋白工藝，并確定了最佳水解工藝所需的溫度、酶添加量等工藝[29]。表1總結了近年來國內外關于酶解魚內臟蛋白制備活性肽的研究進展。這些活性肽雖然有潛在的生理功效，但缺乏完善的臨床實驗而無法對其生理功效提供實質性證據，導致其尚未實現工業化應用。

表1 魚內臟蛋白酶解物中活性肽的氨基酸序列及生理活性Table 1 Amino acid sequences and bioactivities of peptides from protein hydrolysates of fish viscera

2 細菌素

細菌素是某些細菌合成的一類具有抑菌活性的多肽、蛋白或蛋白復合物。細菌素對人體無毒副作用，且不影響食品風味，因此可作為天然防腐劑和保鮮劑[38]。細菌素一直是食品天然防腐劑領域的研究熱點。魚腸道菌群的種類十分豐富，研究表明其中存在多種可合成較強抑菌活性細菌素的細菌。國內研究方面，安俊瑩等從寶石石斑魚腸道解淀粉芽孢桿菌ZJHD-06中分離出一種可抑制單核增生李斯特菌的細菌素[39]。鄧梅等從額爾齊斯河冷水魚腸道篩選到一株產細菌素的耐低溫腸球菌Enterococcussp. MB2-1，研究發現此細菌素可抑制革蘭氏陽性菌李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及革蘭氏陰性菌大腸桿菌。進一步的實驗顯示，此細菌素對胃蛋白酶、胰蛋白酶和尿素敏感，但對過氧化氫酶、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉，吐溫-80和乙二胺四乙酸穩定[40]。國外研究方面，Ghomrassi等從地中海8 種魚類的內臟腸球菌中分離出細菌素，發現得到的細菌素對病魚中致病菌（副乳房鏈球菌、漫游球菌、肉桿菌、寒黃桿菌等）具有廣譜抑菌作用[41]。Sarra等從黑斑小鯛腸道中分離出3 種屎腸球菌，發現這3 種屎腸球菌可產生抑制食品腐敗菌和魚類致病菌的細菌素[42]。

表2 魚腸道菌株細菌素的抑菌特性Table 2 Antibacterial properties of bacteriocins from fish intestinal bacteria

3 內臟蛋白生物降解膜

魚蛋白，包括魚明膠蛋白、肌原纖維蛋白、肌漿蛋白等已被廣泛開發為食品包裝的生物膜[59-61]。但是，將魚內臟蛋白開發為食品級生物降解膜的研究還比較少見。Abdelhedi等采用Purafect蛋白酶，在pH 10、溫度50 ℃、水解時間580 min、比酶活力6 U/mg的條件下水解前鰭星鯊內臟蛋白，并用超濾法得到分子質量小于1 kDa的肽。所得肽液（6%，質量分數，后同）與0.95%甘油（塑化劑）混合并在40 ℃下均質30 min，制成成膜溶液。將適量成膜溶液涂于有機硅樹脂板上干燥成膜，研究發現所得生物降解膜比骨明膠膜抗拉強度更好，但斷裂拉伸率低于骨明膠膜。同時，研究發現內臟蛋白-明膠混合膜的機械強度和玻璃化轉變溫度高于內臟蛋白-明膠雙層膜，而變形性小于雙層膜。混合膜在相對濕度為30%～84%的條件下阻止水分轉移的能力強于雙層膜[62]。

4 蛋白胨

通過酶解等手段，將魚類加工副產物加工為微生物培養所需蛋白胨的研究已進行了數10 年。魚類加工副產物制備蛋白胨的一般步驟包括洗凈、破碎、脫脂、混合液調整pH值、蛋白酶酶解、煮沸滅酶、離心、脫鹽、濃縮、干燥、粉碎等。國內關于魚內臟蛋白胨的研究較少。國外方面，Vázquez等將金槍魚、黃線喉盤魚、劍魚、虹鱒魚的內臟制成各類蛋白胨，以滿足不同種微生物（如假單胞菌、弧菌、玫瑰桿菌等）的生長需要。實驗表明這些魚內臟來源的蛋白胨含有豐富多肽和游離氨基酸，比商業培養基更適于微生物培養[63]。Gildberg等用甲酸和磷酸處理冷肚魚內臟蛋白并將所得自溶物作為3 種病原菌的氮源，發現與月示蛋白胨相比，廣布肉桿菌的生長速度增長了兩倍[64]。與此類似的，Klompong等發現黃鰭金槍魚內臟蛋白經堿性蛋白酶和風味蛋白酶處理后所得蛋白胨對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長促進作用優于商業蛋白胨[6]。以上研究為魚內臟蛋白胨在發酵工業和醫藥工業的應用提供了一定理論基礎。顯然，單一品種的魚內臟蛋白不可能適用于所有種類微生物的生長。因此，選擇不同種類魚的內臟蛋白并調整制備工藝，開發為不同種類微生物生長所需的蛋白胨，具有較大的發掘潛力。

5 內臟酶

魚內臟中的酶活性通常較高，這種特質一方面決定了內臟這一副產物難以長時間保持完整性；另一方面又為從中提取高活性的酶提供了可能性。國內方面，張培等用硫酸銨分級沉淀法從金鯧魚內臟中提取出一種酸性蛋白酶，發現該酸性蛋白酶酶解魚皮明膠的能力和提取蝦殼中蝦青素的能力均優于豬胃蛋白酶；進一步研究發現該酸性蛋白酶的分子質量為18.5 ku，最適pH值為4.0，最適反應溫度為35 ℃[65]。國外方面，Ketnawa等用雙水相萃取法從湄公河巨鲇內臟中提取肽酶，發現這種肽酶對溫度、鹽濃度有很強的耐受性[66]。進一步的實驗表明，該肽酶水解魚皮明膠的能力強于牛胰蛋白酶，且明膠水解液具有ACE抑制活性以及DPPH自由基和2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸陽離子自由基清除活性[67]。Saranya等從大比目魚胃部分離出的一種高活性蛋白酶并將其應用于山羊皮脫毛工藝中，結果表明經該蛋白酶脫毛后的山羊皮，與傳統脫毛工藝后所得的山羊皮粒面效果相當，且廢水中的固形物更少，從而降低了后續廢水處理的成本[68]。Younes等從赤鲉內臟中分離出一種堿性蛋白酶，可作為洗滌劑的添加劑并可應用于蝦副產物脫蛋白[69]。

6 結 語

通過多種技術手段提高魚內臟蛋白類物質的附加值，不僅可帶來可觀的經濟效益，也可完善我國魚類加工副產品綜合利用產業鏈。但在現階段，對魚內臟蛋白類物質的研究仍停留在實驗方面，工業化應用仍偏少，導致其未能達到資源增值、惠及民生的目的。因此，仍需通過實驗不斷增強對內臟蛋白類物質特性的了解，并與其他領域成熟產品建立密切聯系，實現共同發展。

如前所述，魚內臟蛋白水解物具有多種生理活性，對水解物生理活性的研究涉及到抗氧化、ACE抑制、免疫調節、金屬離子螯合、抑菌、抗糖尿病等多個方面。但國內外關于其抗癌能力、抗過敏及其他生理活性的研究還不夠深入。此外，鮮見通過微生物發酵方式制得魚內臟源活性肽的研究。另一方面，大多數關于魚內臟水解物中活性肽的研究為體外實驗，到目前為止，鮮見關于將魚內臟源活性肽加入谷物、甜點或肉類等使之成為功能性食品的報道。

目前，乳酸菌細菌素是唯一商業化使用的細菌素。從自然界中篩選菌種，并運用合適育種方法得到高產細菌素菌株，具有廣闊的開發前景。近年來，魚內臟源產細菌素的研究主要集中在菌種分離篩選和抑菌特性的研究，關于其分子結構鑒定及耐藥機制的研究還不完全。此外，關于魚內臟源細菌素的體外實驗、動物實驗乃至人體實驗的研究還不完善，這也限制了其在食品工業中的應用。進一步地，對魚內臟產細菌素細菌的相關基因組測序工作也需完善。

將魚內臟蛋白應用于生物降解膜的研究還較少。綜合已報道的文獻來看，還需要一定的研究工作來全面提高魚內臟蛋白降解膜的拉伸強度、斷裂延伸率、穿刺強度等機械性能，以及阻水性、阻氣性等阻隔性能。若能改善其制備工藝，并與其他生物降解膜的性能進行綜合對比，應當能拓展此類生物降解膜在食品工業中的開發利用。

商業蛋白胨的價格通常較高，且可能存在營養素比例不平衡、微生物利用率較低等缺點。以魚內臟蛋白通過外源酶酶解或內源酶自水解等手段將魚內臟蛋白研制為蛋白胨，可能會彌補商業蛋白胨的缺陷。由于水生環境中重金屬（汞、鎘、砷、鉻、鉛）超標問題日益突出，魚內臟中重金屬含量通常比其他組織要高[70]。重金屬離子可能對微生物的生長產生抑制作用，因此需將重金屬離子的檢測納入此類蛋白胨的質量控制指標。此外，在工業應用之前，也需對此類蛋白胨的澄清度、亞硝酸鹽含量、酸堿度、含氮量、氨基氮含量、干燥質量損失、熾灼殘渣含量等常見蛋白胨理化指標進行測定，檢測其是否滿足相關質控標準。

酶類尤其是蛋白酶市場需求量極大，但目前市場酶制劑的價格通常較高。以廉價而豐富的魚類內臟酶作為酶的來源，具有極大的市場競爭優勢。多項研究表明魚內臟酶普遍具有良好的酸堿穩定性和耐鹽能力，且活性較高。因此，在提取純化、酶活性、酶學性質等多方面繼續進行深入研究，才能拓展其在食品工業中的應用。