葡萄籽原花青素對自發性高血壓大鼠腎纖維化的改善及腎損傷保護作用

劉尚軍 彭興 周志宏

1海南省第三人民醫院心內科（海南三亞572000）；2海口市人民醫院（?？?70208）

高血壓是心腦血管病最常見的危險因素之一。原發性高血壓（essential hypertension，EH）的特點是體循環動脈壓升高，這可能是環境、遺傳等多種危險因素相互作用造成的全身性疾?。?］。近年來研究報道EH 主要側重于不同治療方法及藥物對自發性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）血管及心腦腎等臟器炎癥的改善作用［2］，而臨床研究多是觀察藥物對EH 患者血清炎癥因子及血壓的影響［3］。

腎臟是高血壓損傷的靶器官之一，也參與了高血壓的形成與發展。目前國內高血壓腎病居慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病后第三位，在國外則已成為終末期腎臟病（ESRD）第二位病因［4］。EH 所致的腎損害發病機制復雜，主要與血流動力學、血管內皮功能失調、自身抗體形成，還與炎癥、氧化應激等因素相關，其中炎癥反應是高血壓引起腎臟病理改變的重要機制之一［5］。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）主要由兒茶素及表兒茶素組成，是從葡萄中提取出來的植物多酚類物質。研究發現，葡萄籽原花青素具有抗氧化（是VE的50 倍、VC的20 倍）、清除自由基、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抑制多種腫瘤細胞生長及保護血管內皮細胞等多種活性［6］。SHR 是目前公認的研究原發性高血壓及其并發癥的動物模型。因此，本研究選擇SHR 作為高血壓動物模型，觀察GSP 對SHR 腎臟損傷的影響，從氧化應激、炎性反應等方面探討GSP 減輕SHR 腎臟損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑葡萄籽原花青素（天津尖峰天然產物研究開發有限公司）；HE 染色試劑盒（美國Sigma 公司）；IL-6、TNF-α酶聯免疫試劑盒（美國R & D 公司）；BCA 蛋白質定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）及Masson 染色試劑盒均（南京建成生物工程研究所）；NF-κB p-p65 兔抗大鼠抗體（美國CST 公司）；TGF-β1 兔抗抗體（英國abcam 公司）；實時定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；病理圖像分析系統Image-ProPlus5.0（美國Media Cybernetics 公司）；大鼠尾動脈血壓測量儀2006A（日本SoftronTM 公司）。

1.2 動物SPF 級雄性20 周齡SHR 大鼠30 只，同周齡雄性（Wistar-kyoto，WKY）大鼠10 只，體質量180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0001，單位使用許可證編號：SYXK（瓊）2015-0023，本研究經本院倫理委員會審核通過（HNSDS-20180015）實驗過程符合動物3R 原則。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組與給藥30 只SHR 隨機分成3 組（每組10 只），分別為SHR 模型組、GSP 低劑量組（100 mg/kg）GSP 高劑量組（250 mg/kg），選擇Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作為WKY對照組（n=10）。WKY 對照組和SHR 模型組每日均給予1 mL 0.9%生理鹽水灌胃，GSP 低劑量組和GSP 高劑量組分別每日給予100、250 mg/kg GSP 灌胃，4 組大鼠灌胃22 周后進行檢測處理。

1.3.2 實驗標本留取用10%水合氯醛麻醉大鼠，抽取腹主動脈血，然后取部分左腎組織，4%多聚甲醛固定，其余腎組織分裝在凍存管中，然后于液氮中保存。

1.3.3 大鼠尾動脈收縮壓（SBP）的測定經22 周治療后，43 周末時采用tail-cuff 測壓法，用大鼠無創尾動脈壓測定裝置和多通道生理信號采集處理系統進行檢測大鼠SBP。

1.3.4 HE 染色將取出的腎組織經4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續切片，厚度約3 μm，行HE 染色，光鏡下觀察腎組織病理學改變。

1.3.5 Masson 染色將制備好的切片置于乙醇中補水，Weigert 蘇木精液中浸染5 min→浸入鹽酸酒精進行分化2 min→麗春紅酸性品紅染色→苯胺藍染色液染，以0.2%冰醋酸水溶液或蒸餾水浸洗片刻。乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察染色結果。

1.3.6 腎組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測將大鼠腎組織制成10%的組織勻漿液，4 ℃下4 000 r/min 離心10 min 后取上清液，嚴格按照GSH-Px 、MDA 試劑盒說明書操作；腎組織混勻后，放置10 min，按照T-AOC、SOD 試劑盒操作說明檢測。

1.3.7 ELISA檢測腎組織中IL-6、TNF-α含量采用ELISA 法檢測腎組織中IL-6、TNF-α 含量，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.8 RT-qPCR 檢測腎組織IL-6、TNF-α mRNA表達水平分別取各組腎組織30 mg，按總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒說明書分別提取各組總RNA 及逆轉錄合成cDNA 模板，取2 μL cDNA用于RT-qPCR 反應。β-actin 作為內參，獨立實驗重復3 次。用系統軟件進行結果分析：樣品的相對表達用2-ΔΔCt表示。

1.3.9 Western Blot法檢測腎組織中NF-κB p-p65、TGF-β1 蛋白水平在腎組織（50 mg）中加1 mL 裂解液，冰上均漿，4 ℃下4 000 r/min 離心10 min，經BCA 法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質、電泳、轉膜后采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗，4 ℃冰箱過夜。加二抗37 ℃2 h，結束后用TBST 漂洗10 min × 3 次，顯影后對蛋白質條帶進行分析，測定其吸光度值。目的蛋白的相對表達強度=目的蛋白的吸光度值/GAPDH的吸光度值。

1.4 統計學方法采用SPSS 17.0 軟件進行分析。計量資料采用（）表示，數據服從正態分布及方差齊性，行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSP 對自發性高血壓大鼠SBP的影響22 周后，與WKY 對照組相比，SHR 各組SBP 值均明顯升高（P＜0.01），而SHR 各組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠腎組織HE 染色各組SHR 腎小球血管較WKY 對照組擴張充血，腎小管上皮細胞水腫，腎間質內有較多的血細胞滲出，腎小管間質內有較多的炎性細胞浸潤。而與SHR 模型組比較，經低、高GSP 治療后上述情況均緩解，炎性細胞浸潤明顯減少，見圖1。

表1 GSP 對自發性高血壓大鼠SBP的影響Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

表1 GSP 對自發性高血壓大鼠SBP的影響Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

注：與WKY 對照組，*P＜0.01

組別WKY 對照組SHR 模型組GSP 低劑量組GSP 高劑量組劑量（mg/kg）100 250給藥后尾動脈收縮壓（mmHg）130±13 190±10*176±13*180±9*

2.3 Masson染色結果觀察經Masson染色后，膠原纖維被染成藍色。WKY對照組大鼠腎間質中膠原纖維線樣分布在腎小管、腎小球周圍，SHR 魔此女孩組大鼠腎臟組織中膠原纖維較WKY 對照組顯著增多。GSP 低、高劑量組大鼠腎臟的膠原纖維增多情況均有所減輕，特別是GSP高劑量組腎小球、腎小管周圍膠原纖維分布較SHR模型組明顯減少。見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of kidney tissue in rats of each group（×200）

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色（×400）Fig.2 Masson staining of kidney tissue in rats of each group（×400）

2.4 腎組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、TGF-β1 含量檢測治療22 周后，GSP 高劑量組中SOD、GSH-Px、T-AOC 值均較SHR 組明顯升高（P＜0.01），TGF-β1、MDA 含量顯著降低（P＜0.01），而GSP低劑量組中TGF-β1、MDA含量降低（P＜0.05），SOD 活性亦升高（P＜0.05）。SHR 模型組中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均較WKY 對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），而TGF-β1、MDA 含量顯著升高（P＜0.01），其他指標之間差異無統計學意義。見表2。

表2 腎組織中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測Tab.2 Detection of TGF-β1，SOD，GSH-Px，T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

表2 腎組織中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測Tab.2 Detection of TGF-β1，SOD，GSH-Px，T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

注：與WKY 對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與SHR 模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別WKY 對照組SHR 模型組GSP 低劑量組GSP 高劑量組SOD（U/mg）212±18.77 162±18.19*209±18.61#244±30.83##GSH-Px（U/mg）69.72±13.30 48.41±13.98*56.42±22.22 77.47±12.13##MDA（nmol/mg）10.55±2.05 20.08±5.78**14.50±0.83#9.20±1.23##T-AOC（U/mg）1.248±0.110 0.944±0.088**0.912±0.076 1.217±0.080##TGF-β1（mg/L）0.501±0.192 0.974±0.334*0.641±0.092#0.532±0.120##

2.5 GSP 對腎組織中炎性因子影響與SHR 模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中IL-6 蛋白及mRNA 表達水平均明顯下降（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中TNF-α蛋白表達明顯下降（P＜0.05），而GSP 低劑量組中TNF-α mRNA 表達水平較SHR 模型組差異無統計學意義（P＞0.05）；SHR 各組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表達水平較WKY 對照組均明顯提高，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 GSP 對腎組織中炎性因子IL-6、TNF-α 表達影響Fig.3 Effects of GSP on the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in renal tissue

2.6 Western Blot 檢測結果與WKY 對照組比較，SHR 各組大鼠腎組織中p-p65 蛋白表達均明顯上升（P＜0.01），而SHR 模型組、GSP 低劑量組、GSP 高劑量組中p-p65 蛋白表達水平逐漸下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

高血壓病是我國最常見的心血管病之一，可引起心、腦、腎、眼等靶器官的并發癥，高血壓所致終末期腎病（ESRD）患病率呈逐年上升趨勢［7］，已取代腎小球疾病成為ESRD的第二病因［8］。臨床防治ESRD 藥物有限且常有副作用，如嚴重低血壓、心律失常、高血鉀等，因此尋找副作用較少且降低高血壓腎功能損害的藥物尤為重要。GSP 是從葡萄籽中提取的特殊分子結構生物類黃酮，主要由兒茶素及表兒茶素組成，具有抗癌、抗氧化、抗炎等藥理活性［9］，其活性與許多高血壓腎損害的機制有關［10］；研究發現［11］，GSP 還具有緩解高血壓所致心血管重塑及降低自發性高血壓大鼠SBP的作用，這提示GSP 對SHR 腎損傷可能具有一定保護作用。

圖4 p-p65 蛋白相對表達Fig.4 Relative expression of p-p65 protein

腎臟是高血壓的主要靶器官之一，高血壓腎損傷的病理機制主要與腎小球高壓、腎臟自動調節功能失調、腎臟微血管結構和功能的改變等有關［12］。22 周后各組SBP 檢測結果，與WKY 對照組相比，SHR 各組SBP 值均明顯升高（P＜0.01），而SHR 各組間差異無統計學意義（P＞0.05），這提示本實驗中GSP 對血壓水平無明顯影響；HE 染色結果表明，SHR 各組腎小球血管較WKY 對照組擴張充血，腎小管上皮細胞水腫，腎間質內有較多的血細胞滲出，腎小管間質內有較多的炎性細胞浸潤，而GSP 治療后能明顯改善上述情況，這說明GSP能有效減輕腎組織炎性細胞浸潤，抑制效果呈現劑量依賴性；經Masson 染色后，SHR 組大鼠腎臟組織中膠原纖維較WKY 對照組顯著增多，而經低、高GSP 治療后膠原纖維減少，同時經GSP 治療后腎組織中TGF-β1 含量明顯下降，這提示GSP 具有明顯抑制纖維化作用。

MDA 可以反映細胞受自由基攻擊后受損的狀況，還能反映腎臟脂質過氧化程度，是機體內脂質過氧化的代謝產物之一［13］；T-AOC 可以反應腎臟的總抗氧化能力的高低，是反應腎臟總抗氧化能力的重要指標；GSH-Px 是機體內重要的過氧化物分解酶，主要清除過氧化氫等自由基，防止脂質過氧化物的生成，保護細胞膜結構和功能完整性的作用；SOD 是酶促防御系的一種重要的氧自由基清除劑，其含量減少將導致自由基的堆積［14］。本研究結果顯示，SHR 模型組中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均較WKY 對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），而MDA 含量顯著升高（P＜0.01），說明抗氧化酶活性受到抑制，高血壓大鼠腎臟處于氧化應激狀態，腎臟的總抗氧化能力降低顯著。治療22 周后，GSP 高劑量組中SOD、GSH-Px、T-AOC值均較SHR 組明顯升高（P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01），這說明抗氧化酶活性明顯恢復，同時腎臟的結構和功能損傷減輕，總抗氧化能力有所提高，GSP 能夠對抗氧化應激反應，從而緩解SHR 腎損傷的作用。

NF-κB 在炎癥反應中起著中心環節的作用，能夠調控眾多炎癥因子（包括TNF-α、IL-6、IL-10等）的表達［15］。本研究中，SHR 各組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表達水平較WKY 對照組均明顯提高。經過22 周的GSP 干預后，與SHR模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表達水平均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），同時SHR 大鼠腎內p-p65 蛋白活性表達降低，因此筆者得出：GSP 能夠通過下調NF-κB 蛋白表達，從而使IL-6、TNF-α表達下降，抑制炎癥反應，發揮腎臟保護作用。

本研究中，GSP 具有減輕SHR 腎損傷的作用，降低了脂質過氧化標志物MDA的水平，提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px 及T-AOC 活性，下一步筆者將重點研究氧化應激通過哪些信號通路作用于NF-κB。