IgA腎病患者全基因組N6-甲基腺嘌呤修飾差異表達圖譜的研究

邱勁軍 朱鵬 戴勇 曾啟昂 王凱 李鳳艷

1深圳市坪山區人民醫院（廣東深圳518118）；2深圳市人民院（廣東深圳518020）；3河南大學護理與健康學院（河南開封475000）

IgA 腎病是一種比較常見的腎小球疾病，其免疫病理特點主要是IgA 免疫復合物附著于腎小球系膜區［1］。在我國，原發性腎小球疾病患者中約半數是原發性IgA 腎病［2］。多數患者患病10～20年最終發展成為終末期腎臟病（end stage renal disease，ESRD）［3］。IgA 腎病臨床表現差異比較大且缺乏特異性的治療方法，導致IgA 腎病治療困難、預后效果差。IgA 腎病的診斷現在主要依靠腎活檢技術即組織病理學免疫病理分析［4］。腎活檢是有創傷性的技術操作，存在一定的風險性。據統計，腎活檢出血者比例高達1/5，少數患者由于采樣引發并發癥需要手術止血甚至行腎切除術［5］。而且，無癥狀的單純鏡檢血尿患者是否需要腎活檢也存在爭議。因此，探索IgA 腎病的發病機制，尋找新的診斷標志物和治療靶點，有利于改善IgA腎病診斷有風險、治療難和預后差的狀況。

近年來，表觀遺傳學在疾病發病機制研究中的作用逐漸受到關注。表觀遺傳修飾不改變基因編碼信息，通過環境因素和細胞內遺傳物質的相互作用影響基因的表達和改變表觀遺傳性狀，其主要方式包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、微小RNA 等修飾［6］。作為一種重要且穩定的表觀遺傳修飾，DNA 甲基化在調控基因表達、維持基因穩定性、胚胎發育等方面發揮重要的生物學作用，與發育以及多種疾病的發生都有密切的關系［7］。研究［8］發現，原核生物中N6-甲基腺嘌呤甲基化修飾能調控DNA 復制、修復、基因表達等重要的過程。N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA）修飾是DNA 腺嘌呤堿基第6 位N 原子上存在的甲基化修飾。最新報道發現，6mA 在真核生物中也比較普遍存在，而且承擔著重要的生物學功能。已有幾篇研究論文揭示了真核生物如綠藻、線蟲和果蠅基因組中存在6mA的修飾，因此其功能和調控機制引發了研究者更多的關注［7-9］。目前，關于6mA 修飾在IgA 腎病發病機制中的研究尚未見報道。隨著第二代測序技術日臻發展和成熟，免疫共沉淀實驗與高通量測序的整合（immunoprecipitation sequencing，IP-Seq），可在全基因組范圍對蛋白結合的位點進行高效而準確的篩選與鑒定，同時也為研究的深入開展奠定基礎。本研究通過使用N6-甲基腺嘌呤抗體富集高甲基化的DNA 片段，將富集的DNA 甲基化區域進行高通量測序，通過生物信息學分析IgA 腎病患者和健康者之間的腺嘌呤甲基化修飾模式的差異，深入探討IgA 腎病的發生、發展機制，進而為IgA 腎病的診斷和治療尋找新靶標。

1 資料與方法

1.1 一般資料2017年6月至2018年4月，中國人民解放軍第九二四醫院腎病中心收治的原發性IgA 腎病患者10 例（經組織病理學免疫病理分析確診），其中男6 例，女4 例，年齡（41.8 ± 12.1）歲，所有患者在腎活檢時均未長期服用糖皮質激素和（或）免疫抑制劑。健康對照者10 例，其中男6 例，女4 例，年齡（43.7 ± 10.3）歲，參與者均無高血壓、糖尿病、慢性腎炎病史，均無蛋白尿。抽取每例IgA 患者和健康者空腹外周靜脈血1 ～2 mL，EDTA抗凝后置于-80 ℃保存。本研究經過醫院倫理委員會批準，所有參與者簽訂知情同意書。

1.2 DNA 樣本制備將樣本分為IgA 腎病組（編號為B01）和正常對照組（編號為N01）兩組樣本。分別取適量的血樣品，用DNA 提取試劑盒。采用NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測純度（OD260/OD80=1.8～2.0）；Qubit 熒光光度計檢測濃度（≥1 ng/μL）；瓊脂糖凝膠電泳（膠濃度1%、電壓120 V、時間45 min）檢測DNA 完整性（100～500 bp）。

1.3 建庫和測序隨機打斷DNA，將一部分DNA作為比對（Input），一部分DNA 用來免疫共沉淀（IP），采用anti-6mA antibody 進行免疫共沉淀反應特異性地富集目的蛋白結合的DNA 片段，對共沉淀獲得的目標序列末端修復，加堿基A、加測序接頭，進行PCR 擴增，最后進行片段篩選獲得目標長度的6mA-IP-seq 文庫，可得B01input、B01IP、N01input 和N01IP 4 個文庫。構建好的文庫經過文庫質控合格后，進行測序。HiSeq 測序所得序列，通過去低質量、去接頭等過程完成數據處理得到可信的目標序列，將過濾后的目標序列用于后續的分析。筆者對原始序列進行過濾，得到高質量的Clean Reads，再進行后續分析。

1.4 生物信息學分析利用DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）進行富集分析：基因本體（gene ontology，GO）分析對甲基化明顯差異的基因分別進行分子功能、生物學過程、細胞組分富集；KEGG 進行信號通路分析，將分析結果進行Fisher 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IP-Seq 分析結果Peaks 是6mA的分布熱點，Peaks的顯著程度代表Peaks 可信程度的指標，pvalue 越小顯著性越大。Peaks 數目用-LOG10（qvalue）計算，本此實驗共測得IgA 腎病組61 465個6mA 位點（peaks）的-Log10（qvalue）＞20，見表1、圖1A。6mA的熱點（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外顯子、內含子、3-UTR、下游2K 和基因間區，其中內含子上分布最多，見圖1B。6mA表達上調基因有2 550 個，6mA 表達下調基因有1 563 個，見圖1C。

2.2 差異甲基化基因的GO 富集分析和KEGG信號通路分析結果

2.2.1 差異甲基化基因的GO 富集分析利用DAVID 在線數據庫對差異基因進行GO 分析發現，其中包括生物過程，細胞成分和分子功能，見圖2。

甲基化差異基因主要涉及分子功能包括蛋白激酶抑制劑的活動、蛋白激酶C 抑制劑活性、N，N-二甲基苯胺單氧酶的活性、核酸綁定、酶抑制劑的活動、脫氧核糖核苷激酶活性、凝血酶受體的活動、菲醌-環氧化物水解酶活性、核內小RNA 綁定、序列特異性DNA 結合轉錄因子的活性、核酸結合轉錄因子的活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄序列特異性DNA 結合轉錄因子的活性、生長激素受體結合、限制脫氧核糖核酸內切酶活性等，見表2。

表1 IgA 腎病患者和正常對照者的Peaks 掃描結果Tab.1 The Peak calling results of IgAN and NC

差異基因主要富集在線粒體電子傳遞、調節肽酶活性、調節磷酸的運輸、對雌激素的刺激做出反應、正調節ATP 生物合成的過程、正調節核苷代謝過程、腎元小管形態發生、腎元上皮細胞形態發生、呼吸電子傳遞鏈、正調節有絲分裂細胞周期階段過渡、軟骨聚合、腎小管形態發生、反應流體剪切應力等生物學過程，見表3。

圖1 IP-Seq 分析結果Fig.1 IP-Seq analysis results

圖2 GO 聚類分析結果對比圖Fig.2 Comparison of GO classification

表2 差異基因的生物過程Tab.1 The list of biological processes

在細胞組成方面，差異基因主要涉及線粒體呼吸鏈復合體Ⅳ、多囊腎蛋白復合體復雜、核常染色質、細胞器內膜、運動型的初級纖毛、抗肌萎縮相關糖蛋白復合體、應力纖維、IgM 免疫球蛋白復合體、肌動蛋白絲、信使核糖核蛋白復合體、γ微管蛋白小復合體、IgA 免疫球蛋白復合體、肌動球蛋白、染色體著絲粒核心區域、高爾基體相關的泡膜等細胞組件，見表4。

2.2.2 差異甲基化基因的KEGG 信號通路富集分析通過KEGG 信號通路富集分析發現，差異基因主要富集在胞吞、刺激神經組織配體-受體作用、鈣離子信號通道、粘著斑等通路，其中胞吞代謝途徑富集倍數最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表達水平顯著下調，見表5 和圖3、4。

3 討論

IgA 腎病是國內較常見的慢性腎臟疾病之一，由于其臨床表現多樣化，多數較隱匿，有些患者僅表現為單純鏡檢血尿或蛋白尿［5］。若能早期診斷IgA 腎病，從發病初期對其采取相應的干預策略，多數IgA 腎病在治療后，系膜細胞增生、腎小球血管袢壞死、間質纖維化程度均會緩解，從而避免ESRD的發生［9］。盡管腎活檢是診斷IgA 腎病的金標準，但是對無癥狀的單純鏡檢血尿者行腎活檢仍存在非議，且可能因此造成不必要的損傷［5］。由于近年來高通量技術的快速發展，表觀遺傳修飾作為基因表達的重要機制逐漸被人們所認識，DNA 甲基化在疾病發生發展中的作用逐漸受到關注。目前關于甲基化的研究焦點主要集中在5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）甲基化修飾參與疾病的發生機制。大量研究［10-11］表明，基因HLA的5′-甲基胞嘧啶異常甲基化與腎細胞癌、腎病細胞瘤、I 型糖尿病腎病等腎臟疾病的發生發展密切相關。最新研究［12］發現，腺嘌呤的N6-甲基修飾在DNA 復制、修復、基因表達調控等方面發揮重要的功能。目前，關于6mA 修飾在IgA 腎病發病機制中的研究尚未見報道。筆者推測6mA 修飾可能與IgA 腎病有一定的相關性。本研究通過6mA-IPSeq技術繪制全基因組腺嘌呤甲基化水平的圖譜，深入了解IgA 腎病的發生、發展機制，可能為IgA 腎病的早期診斷、干預和治療帶來新的契機。

表3 差異基因的分子功能Tab.3 The list of molecular function

表4 差異基因參與細胞組成Tab.4 The list of cellular component

表5 差異基因的KEGG 富集通路列表Tab.5 The list of KEGG pathway richness

圖3 KEGG 信號通路富集圖Fig.3 Richness of KEGG pathway

圖4 胞吞信號通路圖Fig.4 Endocytosis signaling pathway

本研究應用免疫共沉淀聯合高通量測序技術檢測到IgA 腎病組中6mA 位點61 465 個，其中上調基因2 550 個，下調基因1 563 個。從結果顯示，越長的染色體上分布的Reads 數目越多，且分布頻率越高。6mA 甲基化熱點（peaks）主要分布在基因上游2K、5-UTR、外顯子、內含子、3-UTR、下游2K 和基因間區等七個區域，大部分6mA 分布在內含子上。

從GO 分析結果來看，6mA 差異基因主要參與調控遺傳物質DNA 復制、轉錄、合成、修復及轉座等分子功能。近期研究［12］也曾報道，6mA 是一種存在比較廣泛的修飾，它在調控DNA 復制、修復、轉座、轉錄中起著重要作用。而且，齊素文等［13］通過對15 例IgA 腎病患者和15 例健康人外周血單核細胞（PBMC）的H3K4 甲基化進行染色質免疫沉淀分析發現IgA 腎病患者基因組蛋白H3K4 甲基化與健康對照組有顯著差異，H3K4 甲基化可激活基因轉錄。由此推斷，6mA 在IgA 腎病中也發揮調控遺傳物質DNA 復制、轉錄和修復等作用。本實驗結果顯示，6mA 差異基因主要富集在調節腎小管和上皮細胞形態發生、ATP 生物合成的過程、細胞周期等生物過程。有研究證實klotho 基因啟動子超甲基化影響klotho 基因的表達異常，多名研究者在此基礎上發現慢性腎臟疾病患者腎組織和PBMCklotho 基因啟動子甲基化水平的升高與腎小球濾過率及腎間質纖維化有一定的關系［14-15］。腎小管上皮細胞是腎小管間質最主要的固有細胞，細胞膜上有多種轉運蛋白，依賴ATP 供能介導物質轉運，包括介導多種內源性毒素和外源性化學物質的排泄，從而避免組織受多種有毒物質的侵害［16］。 IgA 腎病多伴有腎小管間質損傷，嚴重的小管間質損傷是病情快速進展并最終導致終末期腎功能衰竭的重要原因［17］。本研究通過KEGG 信號通路富集分析發現，6mA 甲基化差異基因主要富集在胞吞、刺激神經組織配體-受體作用、鈣離子信號通道、粘著斑等通路，其中胞吞代謝途徑富集倍數最高，此通路中MHC、TNFRSF、CRHR2、FSHR、PTHR1、CALCR 等基因的6mA 表達水平顯著下調。SUI 等［18］通過比較膜性腎病患者和正常健康人的基因5mC 甲基化程度，從108 個差異基因中篩選出5 個與膜性腎病有關的基因，這5 個基因均表現為低甲基化。近年研究表明，在近端小管mega1in-cubilin 受體介導的胞吞作用可以重吸收腎小球濾過大部分的蛋白質［19］。由本實驗結果推測，胞吞代謝途徑相關基因的6mA 表達異常可能導致胞吞作用無法重吸收腎小球濾過的蛋白質。那么，IgA 腎病的發生、發展可能與胞吞功能失調有關，且可能與胞吞信號轉導通路某些基因6mA 表達下調有關。由此，進一步推測6mA 甲基化在IgA 腎病病程中發揮了重要的作用。

綜上所述，本研究利用免疫共沉淀實驗與高通量測序的整合技術，在全基因組范圍對IgA 腎病DNA N6-甲基腺嘌呤甲基化區位點進行篩選與鑒定，初步篩出了一系列與IgA 腎病相關的差異甲基化基因。在KEGG 信號通路中，胞吞信號通路富集倍數最高，此通路中MHC、TGB1、PIP5K、PLD1、RAB、CLB 等基因的6mA 表達水平顯著下調。這些基因6mA 表達失調可能與IgA 腎病的發生、發展有密切相關性。下一步將結合生物信息學篩選出可能有意義的基因，并對其甲基化程度及位點進行進一步的驗證，以期發現與IgA 腎病相關的基因，為IgA 腎病的預測和診斷提供新的思路和線索。