下調(diào)WRAP53基因表達(dá)對人食管鱗狀細(xì)胞癌EC109細(xì)胞增殖和凋亡的影響

楊新彬 洪厚松 劉太省 張金野 饒旭光

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科（廣州510095）

食管癌是人類常見的一種消化道癌癥［1］，臨床上食管癌患者就診時(shí)以中晚期居多，并且食管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率高，臨床進(jìn)展較快，預(yù)后較差。檢測早期食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的標(biāo)志分子，鑒定可能應(yīng)用于食管癌基因治療的靶基因，是現(xiàn)在食管癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)［2-3］，WRAP53 是最新發(fā)現(xiàn)的P53的自然反義轉(zhuǎn)錄本，同時(shí)證實(shí)了WRAP53 轉(zhuǎn)錄本能翻譯成WRAP53 蛋白［4］。其在多種不同類型組織癌細(xì)胞中過度表達(dá)已被證實(shí)。食管癌組織中WRAP53的表達(dá)及其對食管癌細(xì)胞株增殖及凋亡的影響，國內(nèi)外尚無研究報(bào)道，本研究前期在食管癌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株及食管鱗癌癌組織中均檢測到WRAP53 蛋白的表達(dá)［5］。本研究首次證明了下調(diào)WRAP53 基因表達(dá)抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞的增殖和促進(jìn)EC109 細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步證實(shí)自然反義轉(zhuǎn)錄本W(wǎng)RAP53 參與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程，是食管鱗狀細(xì)胞癌治療的潛在靶點(diǎn)。

1 對象與方法

1.1 研究對象人食管鱗癌細(xì)胞系EC109、EC9706、KYSE150、KYSE180，取自2008年3月至2011年7月行食管癌根治手術(shù)患者85 例，包括食管鱗狀細(xì)胞癌組織以及切緣相對正常食管黏膜上皮組織。男60 例，女25 例，平均年齡（58.56 ± 8.54）歲，術(shù)后病理檢查報(bào)告均為食管鱗狀細(xì)胞癌。

1.2 主要試劑WRAP53 PolyClonal Antibody 購自Proteintech，rabbit beta-actin PolyClonal Antibody 購自Sigma，polyclonal secondary antibodies 購自Sigma，RIPA 裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DAB 顯色試劑盒購自上海長島生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EC109、EC9706、KYSE150、和KYSE180 貼壁培養(yǎng)于裝有1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 ℃溫度且含5%CO2水飽和的培養(yǎng)箱中。細(xì)胞貼壁長成單層后，加入0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)目約（2 ～4）× 107后，收取細(xì)胞，立即用于提取細(xì)胞總蛋白。

1.3.2 細(xì)胞總蛋白的提取使用碧云天生物技術(shù)研究所生產(chǎn)的RIPA 裂解液（1）人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后，用4 ℃預(yù)冷的PBS（pH 7.4）洗滌細(xì)胞2 次。（2）去凈培養(yǎng)瓶中PBS 殘液后，每個(gè)培養(yǎng)瓶加400 μL的RIPA 裂解液（含100 mmol/L PMSF），將培養(yǎng)瓶置于冰上裂解20 min，每5 min 搖動培養(yǎng)瓶1 次。（3）裂解完畢后收集細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶中混合物轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中。（4）將離心管繼續(xù)置于冰上，裂解20 min。然后在4 ℃，12 000 ×g條件下離心5 min。（5）BCA 法測定總蛋白含量。

1.3.3 蛋白電泳收集細(xì)胞，提取總蛋白，Western Blot電泳，具體方法如下：細(xì)胞經(jīng)PBS清洗兩次，加入RIPA 裂解液后，冰上裂解20 min，在12 000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，收集上清。調(diào)整各細(xì)胞蛋白總量相等，加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，在100 ℃條件下加熱5 min，同時(shí)配制10%的分離膠和5%的濃縮膠。各孔加入等量的上樣蛋白，恒壓60 V，至樣品進(jìn)入分離膠，約30 min；恒壓120 V，溴酚藍(lán)至分離膠底部停止電泳約90 min。PVDF 膜先在甲醇中浸泡2 min，在轉(zhuǎn)緩沖液中平衡5 min；進(jìn)一步在半干轉(zhuǎn)緩沖液中平衡15 min，在半干電轉(zhuǎn)移儀中依次放入海綿墊、濾紙、PVDF 膜、凝膠、濾紙和海綿墊并壓緊，恒壓100 V 條件下轉(zhuǎn)移120 min后，取出PVDF膜，置入含5%脫脂奶粉的TBS溶液，在室溫下封閉30 min。加入用TBST 稀釋的一抗（WRAP53，1∶500；beta-actin 1∶1 000），作用30 min后，PVDF 膜經(jīng)4 ℃孵育過夜，分別用TBST 洗滌3 次，每次10 min，過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫作用2 h，再次用TBST 洗滌3 次，每次10 min。使用SantaCruz 公司化學(xué)發(fā)光試劑盒，按操作說明進(jìn)行發(fā)光實(shí)驗(yàn)，在發(fā)光前1 min 混合A、B 液，使混合液與PVDF 膜蛋白面接觸1 min 后，將膜置于暗盒中，加化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)1 min，在暗室內(nèi)加上底片，洗片顯示目的條帶。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法（1）組織取材后固定、包埋蠟塊，進(jìn)一步切片和貼片、脫蠟水化。（2）置入3%的過氧化氫水溶液中浸泡10 min，去除內(nèi)源性過氧化物酶，反復(fù)用蒸餾水沖洗3 次，使用高壓抗原修復(fù)。（3）反復(fù)用PBS 沖洗3 次，甩干玻片上的液體，然后吸水紙吸干組織塊邊緣的液體，用10%正常山羊血清室溫下封閉15 min。（4）滴加一抗后，于4°C 冰箱濕盒中孵育過夜。PBS 沖洗3 次，每次5 min，甩干玻片上的液體。（5）滴加二抗（生物素標(biāo)記的山羊抗鼠抗兔抗體），室溫孵育10 min，PBS液沖洗3 次，每次3 min。滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫條件下孵育10 min。（6）PBS 沖洗3 次，每次5 min，甩干玻片上的液體，滴加DAB 溶液2 min 后在顯微鏡下觀察顯色情況，用自來水終止顯色，進(jìn)一步蘇木素染液染色5 ～10 min，自來水沖洗2 min；1%鹽酸酒精分化約3 s，自來水沖洗1 ～2 min，淡氨水溶液浸泡45 s，自來水沖洗至細(xì)胞核深藍(lán)，蒸餾水沖洗30 s。（7）梯度酒精脫水至切片清晰透明，中性樹脂封片晾干，光學(xué)顯微鏡下圖像攝影。

評分標(biāo)準(zhǔn)：A，按染色強(qiáng)度劃分等級：0，無染色；1，弱染色；2，中度染色；3，強(qiáng)染色。B，按癌巢組織中的陽性細(xì)胞數(shù)劃分等級：0，陰性；1，＜10%；2，11% ～50%；3，51% ～80%；4，＞81%。最后將A和B 分?jǐn)?shù)相乘得出綜合評分進(jìn)一步分級：0，陰性表達(dá)；1 ～3 分，弱陽性表達(dá)；4、6 分，陽性表達(dá)；8、9、12 分，強(qiáng)陽性表達(dá)，本研究以4 分及以上作為WRAP53 陽性表達(dá)，4 分以下作為陰性表達(dá)。

1.3.5 MTT 法（1）處于對數(shù)生長期的EC109 細(xì)胞，胰酶消化后用含血清培養(yǎng)基稀釋至5 × 104/mL重懸，接種到96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。（2）消毒PBS 洗3 次，設(shè)計(jì)4 個(gè)處理組，分別為細(xì)胞對照組（Normal 組，不進(jìn)行轉(zhuǎn)染）、空白對照組（Mock組，轉(zhuǎn)染時(shí)加入不含siRNA的脂質(zhì)體）、無義對照組（NC 組，以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染非特異性siRNA）、特異性siRNA處理組（siWRAP53-E5組），分別加入①含血清培養(yǎng)基；②單純加轉(zhuǎn)染試劑的含血清培養(yǎng)基；③加非特異性siRNA 和轉(zhuǎn)染試劑的含血清培養(yǎng)基，終濃度為5 nmol/L。（3）加特異性siRNA和轉(zhuǎn)染試劑的含血清培養(yǎng)基，終濃度為5 nmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 ～72 h。（4）常規(guī)培養(yǎng)24 后檢測第1 批樣品，吸去培養(yǎng)基，加入90 μL 無血清培養(yǎng)基，每孔加入10 μL MTT（5 mg/mL），輕輕混勻后在避光條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（5）吸去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 100 μL，搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm 處測量各孔的吸光值。（6）同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（DMSO），對照孔（新鮮培養(yǎng)基），每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。培養(yǎng)36、48、72 h的細(xì)胞用相同方法檢測，以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸作細(xì)胞生長曲線。

1.3.6 RNA 干擾RNA 干擾實(shí)驗(yàn)使用化學(xué)合成的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）針對WRAP53 序列，siRNA 由上海吉瑪公司合成，處理食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞，使用HiPerFect Transfection Reagent，按照轉(zhuǎn)染試劑操作規(guī)程，24 ～48 h 后收集細(xì)胞，檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果使用SPSS 13.0進(jìn)行分析。在Excel 中計(jì)算均值±標(biāo)準(zhǔn)差，所有P值采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WRAP53 在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系中的表達(dá)為闡明WRAP53 蛋白與食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞之間的關(guān)系，本研究首先用Western Blot 檢測不同來源的4 種食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株（EC109，EC9706，KYSE150 和KYSE180）中WRAP53 蛋白的表達(dá)情況。免疫印跡法檢測顯示靶蛋白的分子量為75 kDa，β-actin 作為內(nèi)參照，分子量為43 kDa。在4 種來源不同的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中均檢測出WRAP53 蛋白的表達(dá)，見圖1。

圖1 WRAP53 在4 種不同的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)Fig.1 Expression of WRAP53 protein in four different ESCC cell lines

2.2 WRAP53 蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和正常食管黏膜上皮組織中的表達(dá)差異筆者使用免疫組織化學(xué)法檢測85 例食管鱗狀細(xì)胞癌組織和癌周正常黏膜上皮組織中WRAP53 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中WRAP53 主要定位于腫瘤細(xì)胞核上，顯示黃色或者棕黃色染色，見圖2。食管鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)明顯高于癌周正常黏膜上皮組織。65 例（76.5%）WRAP53呈陽性或強(qiáng)陽性表達(dá)，20 例（23.5%）WRAP53 呈陰性或弱陽性表達(dá)，而在癌周正常黏膜上皮組織中，僅22 例（25.9%）的樣本呈陽性表達(dá)（χ2= 61.574，P＜0.001）。

圖2 WRAP53 蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織上的表達(dá)Fig.2 WRAP53 protein expression in ESCC tissue

2.3 下調(diào)WRAP53 基因表達(dá)抑制人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞的增殖本研究用MTT 法在體外檢測WRAP53 下調(diào)表達(dá)后對細(xì)胞分裂增殖的影響。細(xì)胞生長曲線（圖3）顯示，EC109 細(xì)胞的WRAP53 基因下調(diào)表達(dá)后，siWRAP53-E5 組的EC109 細(xì)胞增殖速率在轉(zhuǎn)染后36、48、72 h 較3 個(gè)對照組明顯下降（P＜0.05）。但3 個(gè)對照組之間無明顯差別（P＞0.05），siWRAP53-E5 組的EC109 細(xì)胞24、36、48、72 h的增殖抑制率分別是（23.33 ±1.33）%，（29.91±2.19）%，（41.49±1.32）%和（36.01±1.72）%。

2.4 下調(diào)WRAP53 基因表達(dá)促進(jìn)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞的凋亡筆者運(yùn)用免疫印跡法檢測EC109 細(xì)胞WRAP53 表達(dá)下調(diào)后BAX 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示siWRAP53-E5 組BAX 蛋白表達(dá)升高（圖4），以上結(jié)果表明WRAP53 表達(dá)下調(diào)促進(jìn)食管鱗癌EC109 細(xì)胞的凋亡。

3 討論

圖3 MTT 法檢測WRAP53 表達(dá)下調(diào)對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of siWRAP53-E5 on proliferation of EC109 Cells

圖4 免疫印跡法分析WRAP53 表達(dá)下調(diào)與凋亡蛋白的關(guān)系Fig.4 Effects of WRAP53 knockdown on apoptotic proteins

食管癌的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，針對食管癌正確選擇合適的標(biāo)志物或標(biāo)志群，是早期診斷食管癌的關(guān)鍵。自然反義RNA 是近年腫瘤研究的新靶點(diǎn)，它與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。對大多數(shù)自然反義轉(zhuǎn)錄本的研究，首先是通過研究自然反義轉(zhuǎn)錄本對正義轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控，進(jìn)一步影響正義轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白而發(fā)揮各項(xiàng)功能，最近部分自然反義轉(zhuǎn)錄本被證實(shí)能直接編碼蛋白而在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［5-10］。

抑癌基因p53 是迄今發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤研究相關(guān)性最高的基因，WRAP53 是最近被鑒定出來p53的自然反義轉(zhuǎn)錄本，WRAP53 基因在染色體17p13 上與p53 基因以“頭對頭”的方式重疊，對WRAP53的研究［4，11］開始主要集中于對p53的調(diào)控作用，p53 基因的反義序列WRAP53 可以調(diào)控內(nèi)源性的p53 mRNA 水平，并且靶向作用于p53 mRNA的5′非翻譯區(qū)進(jìn)一步誘導(dǎo)p53 蛋白的表達(dá)，近來的研究證實(shí)WRAP53 直接參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，有研究［6，12-13］表明WRAP53（也可表示為TCAB1 或WDR79）作為端粒酶蛋白能促使端粒酶聚集于卡哈爾體并且延長端粒的長度，端粒酶能通過增加染色體末端端粒的長度促進(jìn)原始細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖，2011年MAHMOUDI 等［7］檢測不同癌細(xì)胞（U2OS、PC3、MCF-7、SK-N-AS、H1299、HCT116、HEK293、HeLa、Raji、BL41、EW36、ME-180、C33A、SW480、SW756、Saos-2）WRAP53 蛋白的表達(dá)比原始細(xì)胞高20 倍以上。YUAN 等［14］在肺腺癌組織中檢測到WRAP53 蛋白過表達(dá)，本研究在不同來源的食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系（EC109、EC9706、KYSE150 和KYSE180）中均檢測到WRAP53 蛋白的表達(dá)，同時(shí)，本研究檢測到食管鱗狀細(xì)胞癌組織中陽性表達(dá)明顯高于正常食管黏膜上皮，WRAP53蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中過表達(dá)，提示W(wǎng)RAP53 蛋白的表達(dá)與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān)。

自然反義轉(zhuǎn)錄本對腫瘤細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，PENG 等［15］報(bào)道AFAP1-AS1 在肺癌組織及細(xì)胞株中過表達(dá)，下調(diào)AFAP1-AS1的表達(dá)能抑制肺癌H1299 細(xì)胞增殖。FENG 等［16］研究顯示，自然反義轉(zhuǎn)錄本PHBP1 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中表達(dá)升高，下調(diào)PHBP1的表達(dá)使食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞EC9706 和TE-1 細(xì)胞在G1～G0 期細(xì)胞周期停滯，進(jìn)一步抑制細(xì)胞的增殖。PAN 等［17］研究發(fā)現(xiàn)通過RNA 干擾技術(shù)過表達(dá)MAPT-AS1 促進(jìn)雌激素受體陰性乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-468 細(xì)胞的增殖，下調(diào)LncRNA MAPT-AS1 表達(dá)能抑制雌激素受體陰性乳腺癌MDA-MB-231 和MDA-MB-468 細(xì)胞的增殖，LncRNA MAPT-AS1 與雌激素受體陰性乳腺癌細(xì)胞的生長、侵襲相關(guān)。YUAN 等［14］研究表明WRAP53 下調(diào)能抑制肺腺癌A549 和SPC-A-1細(xì)胞的增殖，本研究證實(shí)WRAP53 蛋白在食管鱗狀上皮基底層細(xì)胞、基底層上方細(xì)胞、乳頭狀增生細(xì)胞呈陽性表達(dá)［5］，本研究進(jìn)一步用特異性siWRAP53-E5 轉(zhuǎn)染食管鱗癌細(xì)胞EC109 細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測WRAP53 表達(dá)下調(diào)對EC109 細(xì)胞增殖能力的影響，生長曲線顯示與對照組相比，EC109 細(xì)胞增殖速率明顯下降，在國內(nèi)外首先證實(shí)了WRAP53 表達(dá)下調(diào)能抑制EC109 細(xì)胞的增殖，提示自然反義轉(zhuǎn)錄本W(wǎng)RAP53 與食管鱗狀細(xì)胞癌腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性。

自然反義轉(zhuǎn)錄本在腫瘤細(xì)胞的凋亡中也起到重要作用，ZHANG 等［18］報(bào)道AFAP1-AS1 在肝細(xì)胞癌組織織過表達(dá)，下調(diào)AFAP1-AS1的表達(dá)能誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌SMCC7721 和HepG2 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。MAHMOUDI 等［7］研究證實(shí)應(yīng)用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)WRAP53 表達(dá)能通過線粒體通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，激活凋亡促進(jìn)蛋白Bax/Bak的表達(dá)，減少線粒體膜的跨膜電位和細(xì)胞色素C的釋放，凋亡抑制蛋白Bcl-2的過表達(dá)能阻斷WRAP53表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致的凋亡，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞對WRAP53 敲除引起的凋亡更敏感，進(jìn)一步說明腫瘤細(xì)胞更依靠WRAP53的表達(dá)生存。BAX 是Bcl 基因家族中的一員，主要是通過加速線粒體中的細(xì)胞色素C（cyt-c）釋放和增加Caspase酶的活性來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。本研究顯示W(wǎng)RAP53 表達(dá)下調(diào)后促凋亡蛋白BAX 蛋白表達(dá)明顯升高，抑制WRAP53 表達(dá)能促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞的凋亡。

總之，WRAP53 蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)較正常食管黏膜上皮組織中的表達(dá)升高，提示W(wǎng)RAP53 與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性，WRAP53 表達(dá)下調(diào)能抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC109 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)EC109細(xì)胞的凋亡。隨著WRAP53 研究的進(jìn)一步深入，自然反義轉(zhuǎn)錄本W(wǎng)RAP53 在食管癌中的作用機(jī)制進(jìn)一步明確，為食管癌的治療提供潛在可利用的分子靶點(diǎn)。