配對相關同源框1蛋白在肝癌中的表達及其過表達對肝癌細胞侵襲轉移的影響

盧沛林 尹東亮 尹潤龍 林志強

東莞市人民醫院普外科（廣東東莞523000）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種具有高度轉移，易復發等特性的惡性腫瘤，其發病率較高，治療難度較大，占原發性肝癌的90%以上［1］。最新權威數據顯示，我國肝癌發病率高居第三位，5年生存率僅為14.1%，遠低于日本的60.3%和韓國的68.9%［2］。因此，尋找肝癌預后標志物以及進一步深入研究肝癌惡性進展的分子機制，對肝癌預后判斷、治療策略選擇等均具有重要的指導價值。配對相關同源框1（paired related homoeobox 1，PRRX1）是一個新發現的上皮間充質轉化誘導因子，參與腫瘤轉移的調控。最近有研究顯示，PRRX1的異常表達與各種腫瘤的不良預后顯著相關，包括結腸癌［3］、乳腺癌［4］等。然而，PRRX1 對不同類型腫瘤的預后相關性截然不同。在結腸癌中PRRX1 高表達與患者預后差顯著相關［3］，而在乳腺癌［4］中則截然相反。然而，有關PRRX1 在肝癌中表達及其具體的臨床意義的研究鮮有報道。本研究首先檢測了PRRX1 蛋白在肝癌組織中表達情況，分析了其與肝癌患者臨床病理參數的關系，然后在細胞水平研究了PRRX1 過表達對肝癌細胞侵襲轉移的影響，旨在為肝癌的治療和預后判斷提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本收集2011年5月至2013年1月期間在東莞市人民醫院腫瘤科收治并經手術切除的65 例原發性肝細胞癌患者癌組織標本及其對應癌旁組織標本。其中男42 例，女23 例；年齡25～76 歲，平均55.4 歲；臨床病理TNM 分期為Ⅰ期18 例，Ⅱ期27 例，Ⅲ期15 例，Ⅳ期5 例。所有入選患者術前均未進行放療、化療或其他抗癌治療，且術后經病理證實肝細胞癌。本研究使用的臨床組織樣本均獲得患者同意及醫院倫理委員會批準。

1.1.2 細胞及主要試劑人肝癌細胞株SMMC 7721 購自中國科學院細胞庫；PRRX1 過表達質粒（pGMLV-PA1-PRRX1）構建及慢病毒（2.5×108TU/mL）購自吉滿生物科技（上海）有限公司；CCK-8 試劑盒購自上海碧云天有限公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；Matrigel 基質膠購自美國BD公司；PRRX1 多克隆抗體購自美國Novus 公司；MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin 和GAPDH 單克隆抗體均購自美國CST 公司；PrimeScriptTM RT Reagent Kit 及SYBR?Green PCR Kit 購自日本Ta-KaRa 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化檢測肝癌組織中PRRX1蛋白表達所有標本進行均進行石蠟包埋、切片、脫水，3%H2O2封閉30 min，0.01 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖溶液高壓修復15 min，山羊血清室溫封閉30 min，滴加PRRX1 多克隆抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后滴加生物素標記二抗室溫靜置30 min，DAB 顯色3 min、蘇木素復染、封片，拍照觀察。根據細胞漿及細胞核出現的棕褐色顆粒樣染色細胞數目和染色強度判定陽性表達情況。具體參考范丹等［5］評分方法：每個樣本在400 倍鏡下選擇10 個陽性染色區域分別計算100 個腫瘤細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。評分標準如下：＜5%，0分；5%～25%，1分；25% ～50%，2 分；＞50%，3 分。染色強度判斷：淺黃色，1 分；深黃色，2 分；棕褐色，3 分。總計分為二者計分之和，總計分≤2 為陰性或低表達，＞2分為陽性或高表達。

1.2.2 細胞培養及感染復蘇人肝癌SMMC7721細胞株于培養皿中并置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養、傳代。取對數生長期的SMMC7721 細胞，以2 × 105/孔的密度接種于6 孔板中。設置對照組、空載組和過表達組，以復感染指數（MOI）值為50 加入感染培養基和病毒感染SMMC7721 細胞，感染8 h 后更換新鮮培養基繼續培養，5 d 后采用qRT-PCR 和Western Blot 實驗檢測PRRX1 mRNA 和蛋白表達水平，確定感染效率。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞活性調整3 組細胞濃度為2×103個/孔，各取100 μL 細胞懸液分別接種于96 孔板中，置于培養箱中培養12、24、48 和72 h。培養時間結束后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光孵育1 h，使用酶標儀在波長450 nm 處讀取OD值，細胞活力以測取得OD值表示。

1.2.4 qRT-PCR 檢測細胞中PRRX1 mRNA 表達水平收集各組細胞，采用Trizol 法提取細胞總RNA，使用紫外分光光度計進行定量。根據Prime-ScriptTM RT Reagent Kit 將RNA 逆轉錄成cDNA，以cDNA 為模板使用SYBR?Green PCR Kit 進行PCR擴增，以GAPDH 為內參，采用2-△△Ct法計算mRNA表達量。引物序列，PRRX1 上游：5′-GCACAGGCGGATGAGAAC-3′，下游：5′-TCTTCTGAGTTCAGCTGGTCAT-3′；GAPDH 上游：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游：5-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。PCR條件為：95 ℃預變性1 min，94 ℃變性15 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共40 個循環，72 ℃延伸7 min。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細胞侵襲時，需要提前將Matrigel 膠均勻平鋪于上室，制成凝膠；檢測細胞遷移時，上室不需要平鋪Matrigel 膠，其余步驟一致。調整細胞濃度為1×105個/mL，上室接種200 μL 細胞懸液，下室加入500 μL 10%胎牛血清的培養液，置于培養箱中培養48 h。取出下室，洗滌、加入40 g/L 多聚甲醛固定，結晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，選取5 個隨機視野，統計視野中細胞數目，取平均值為侵襲或遷移的細胞數量。

1.2.6 Western Blot 實驗收集各組細胞沉淀，加入細胞裂解液，冰上充分裂解30 min，4 ℃，12 000 r/min 離心25 min，收集上清，Bradford 法蛋白定量。取25 μg 蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，并將蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。次日，洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h，加入適量ECL 超敏發光液，顯影。

1.2.7 隨訪對納入研究的肝癌患者進行為期5年的隨訪，開始時間為患者接受手術切除后即可起，隨訪最終截止時間為2018年1月13日。隨訪方式為門診隨訪和電話隨訪相結合，平均每3 個月隨訪一次，患者死亡時間作為單個病例隨訪截止時間，中途失訪3 例，失訪患者按照存活病例納入生存分析。

1.3 統計學方法采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理，數據采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗。采用χ2檢驗分析PRRX1 蛋白表達與臨床病理特征參數相關性；采用Kaplan-Meier 法進行生存分析，采用Logrank Test 進行生存曲線間比較；運用Cox 回歸模型進行多因素生存分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PRRX1蛋白在肝癌中的表達情況及臨床病理特征分析免疫組化結果顯示，PRRX1 蛋白在細胞核及胞漿中均有表達（圖1）。據統計，PRRX1蛋白在肝癌組織中的陰性表達率為73.85%（48/65），在癌旁組織中的陰性表達率為18.46%（12/65），差異有統計學意義（P＜0.001）。臨床病理特征分析結果顯示，PRRX1 蛋白陰性表達率與患者年齡、性別、腫瘤大小、血清AFP 含量、HBsAg、anti-HCV、肝硬化、腫瘤數目等臨床病理特征參數無明顯相關性（P＞0.05），與血管侵犯、肝內轉移、遠端轉移和TNM 分期等臨床病理特征參數有顯著相關性（P＜0.05，表1）。Cox 回歸模型分析顯示血管侵犯、遠端轉移和PRRX1 陰性表達可以作為肝癌患者獨立的生存預測因子（P＜0.05，表2）。

圖1 PRRX1 在肝癌組織和癌旁組織中的表達（×200）Fig.1 PRRX1 expression in hepatocellular carcinoma tissues and adjacent tissue（×200）

表1 PRRX1 蛋白表達與肝細胞癌患者臨床病理參數的關系Tab.1 Correlation of PRRX1 expression with the clinicopathological features of patients with hepatocellular carcinoma 例（%）

表2 Cox 回歸模型對肝細胞癌患者預后參數的多因素分析Tab.2 Multivariate analysis of prognostic parameters in patients with hepatocellular carcinoma by Cox regression analysis

2.2 PRRX1 蛋白陰性表達與肝癌患者預后的關系Kaplan-Meier 分析顯示，PRRX1 蛋白低表達組患者中位生存時間為22.5 個月，PRRX1 蛋白高表達組患者中位生存時間為45 個月。Log-rank Test分析顯示，PRRX1 蛋白低表達患者5年生存率顯著低于PRRX1 蛋白高表達患者，差異有統計學意義（P＜0.01，圖2）。提示，PRRX1 低表達與肝癌患者預后差有一定的關聯。

圖2 PRRX1 蛋白表達與肝癌患者預后的關系Fig.2 Correlation of PRRX1 expression with the prognosis of patients with hepatocellular carcinoma

2.3 過表達PRRX1 對肝癌細胞SMMC7721 活力的影響Western Blot 分析結果顯示，與對照組和空載組比較，過表達組PRRX1 蛋白表達顯著增加（P＜0.05，圖3A）。qRT-PCR 結果顯示，與對照組和空載組比較，過表達組PRRX1 mRNA 表達顯著增加（P＜0.05，圖3B）。提示，PRRX1 過表達的SMMC7721 細胞株構建成功。采用CCK-8 技術檢測感染后細胞活力，結果顯示過表達組在感染后48、72 h 時其細胞活力顯著低于對照組和空載組（P＜0.05，圖4）。

2.4 過表達PRRX1 對肝癌細胞SMMC7721 侵襲與遷移能力的影響Transwell 實驗結果顯示，與對照組和空載組比較，過表達PRRX1 可顯著抑制SMMC7721 細胞的侵襲能力（P＜0.05，圖5）；同時，Transwell 實驗結果也顯示，過表達組細胞遷移能力顯著低于對照組和空載組比較（P＜0.05，圖6）。

圖3 PRRX1 蛋白和mRNA 在感染后SMMC7721 細胞中的表達Fig.3 The expression of PRRX1 protein and mRNA in infected SMMC7721 cells

圖4 CCK-8 檢測感染后SMMC7721 細胞活力Fig.4 The cell viability of SMMC7721 cells after infection were detected by CCK-8 analysis

2.5 過表達PRRX1 對肝癌SMMC7721 細胞中侵襲轉移相關蛋白表達的影響Western Blot 檢測結果顯示，與對照組和空載組比較，過表達PRRX1可顯著下調MMP2、MMP9 以及間質表型標志物Vimentin 等蛋白的表達，并且同時可上調上皮表型標志物E-cadherin的表達（P＜0.05，圖7）。

圖5 PRRX1 過表達對SMMC7721 細胞侵襲能力的影響（×200）Fig.5 The effect of PRRX1 overexpression on the invasion ability of SMMC7721 cells（×200）

圖6 PRRX1 過表達對SMMC7721 細胞遷移能力的影響（×200）Fig.6 The effect of PRRX1 overexpression on the migration ability of SMMC7721 cells（×200）

圖7 PRRX1 過表達對MMP-2、MMP-9、E-cadherin 和Vimentin 蛋白表達的影響Fig.7 The effect of PRRX1 overexpression on the protein expression of MMP-2，MMP-9，E-cadherin and Vimentin

3 討論

PRRX1 基因位于人1q24.2 染色體上，其編碼的是一種由245 個氨基酸組成的分子量為27.3 kDa的小分子蛋白物質，該蛋白通過增加血清反應因子的DNA 結合活性起轉錄共激活的作用，可調節間充質前體細胞的分化［6］。作為轉錄因子，PRRX1 基因可參與多種生理機制的調控。例如，已證實PRRX1 是一種新的EMT 誘導因子，并且與多種類型腫瘤患者預后相關［3-4］。

GUO 等［7］對125 例胃癌患者癌組織及對應癌旁組織標本進行檢測分析，發現PRRX1 在胃癌組織中呈現高表達，并且與腫瘤浸潤的深度，EMT 標志物蛋白Vimentin、N-cadherin 和β-catein 表達呈正相關性。TAKAHASHI 等［3］研究顯示，PRRX1 高表達與結腸癌患者預后較差相關。本研究結果顯示，PRRX1 在肝癌組織中的陽性表達率顯著低于癌旁組織，其表達水平與肝癌患者血管侵犯、肝內轉移、遠端轉移和TNM 分期等參數有顯著相關性，并且PRRX1 陰性表達肝癌患者5年生存率顯著低于PRRX1 陽性表達肝癌患者。說明，PRRX1在肝癌中呈現低表達，并且患者預后差相關。這一研究結果與其他類型腫瘤中相關結果不一致，可能是由于腫瘤干細胞樣特性誘導所致。有研究顯示，由于干細胞樣特性誘導，PRRX1 在不同腫瘤中的表達和功能可能存在差異［8］。另外，ZHU 等［9］研究也顯示，在肺癌A549 細胞中抑制PRRX1 表達可增強腫瘤干細胞標志物表達，促進腫瘤干細胞樣特性的獲得，進而誘導EMT。進一步證實，PRRX1 在肝癌中表達與其他類型腫瘤表達結果不一致，可能是由于在肝癌中PRRX1 低表達獲得了腫瘤干細胞樣特性所致。

EMT 是上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用［10］。為了進一步探討PRRX1 對肝癌侵襲轉移的影響，本研究通過慢病毒介導PRRX1 過表達載體感染肝癌SMMC7721 細胞，成功構建PRRX1 過表達的SMMC7721 細胞株。結果顯示，PRRX1 過表達可顯著抑制SMMC7721 細胞侵襲和轉移能力。提示，PRRX1 可能參與肝癌EMT的調控。E-cadherin 被認為是上皮表型標志物，Vimentin 則是間質表型標志物，二者表達變化被認為是EMT 過程的標志［11］。此外，MMP-2 和MMP-9 是基質金屬蛋白酶（MMPs）家族中重要成員，參與細胞外基質和基底膜的降解，在惡性腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用［12］。本研究結果顯示，PRRX1 過表達可顯著抑制Vimentin、MMP-2和MMP-9 等蛋白的表達，促進E-cadherin 蛋白的表達。說明，PRRX1 過表達可抑制肝癌細胞EMT 過程。提示，PRRX1 可抑制肝癌細胞侵襲轉移。ZHU 等［9］研究也表明，PRRX1 缺失可通過上調N-cadherin、Vimentin 表達及下調E-cadherin 表達誘導肺癌A549 細胞發生EMT，從另外一面證實PRRX1 也可抑制肺癌A549 細胞EMT 過程。然而又有研究［13］表明，PRRX1 可通過調節EMT 促進胰腺癌侵襲和轉移。探究其原因，依舊可能是由于腫瘤干細胞樣特性誘導，導致PRRX1 在不同類型腫瘤細胞中表達和功能存在差異。

綜上所述，本研究證實PRRX1 在肝癌組織中低表達，其低表達與肝癌患者預后差相關，并進一步通過體外實驗探討了PRRX1 過表達可抑制肝癌SMMC7721 細胞的侵襲、遷移及EMT，闡明PRRX1在肝癌侵襲轉移過程中扮演的重要作用。該研究對PRRX1 抑制肝癌侵襲轉移的機制闡述還不夠透徹，且并未發掘PRRX1 在肝癌發展進程中更多的功能，后續需要進一步深入研究。