去泛素化酶3在肝癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲中的作用及機(jī)制

楊勤 李婷婷 簡長春 雍熙

1川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（四川南充637000）；2川北醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（四川南充637199）

肝細(xì)胞癌是世界范圍內(nèi)第五大常見的癌癥類型，也是第三大與癌癥相關(guān)的死亡原因［1］。肝癌的預(yù)后非常不理想，可能與診斷較晚、化療耐藥、缺乏有效的治療方法、術(shù)后復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移性高等原因有關(guān)［2］。此外，肝癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚不清楚。因此，迫切需要闡明介導(dǎo)肝細(xì)胞癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，發(fā)展更有效的治療方法以提高肝癌患者生存率。

去泛素化酶3（deubiquitinating enzyme 3，Dub3）屬于泛素特異性蛋白酶家族成員，可以拮抗E3 泛素連接酶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)泛素化和降解，可將靶蛋白去除泛素修飾以促進(jìn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定［3-5］。研究［6-8］發(fā)現(xiàn)，Dub3 可與CDC25A、SNAIL 等致癌蛋白特異性結(jié)合，并且穩(wěn)定它們以促進(jìn)鼻咽癌等細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲。但是，Dub3 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)情況尚無報道，因此本研究使用RNA 干擾技術(shù)沉默Dub3表達(dá)，以研究Dub3 在肝癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑siRNA-Dub3 和siRNA-Control 序列由吉凱基因公司設(shè)計和合成；HepG2 細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫；LipofectamineTM2000 購于Invitrogen公司；一抗購于Santa Cruz 公司；二抗購于Proteintech 公司；Trizol 購于Promega 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于Takara 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2 細(xì)胞。將HepG2 細(xì)胞隨機(jī)分為Blank 組、siRNA-Control 組和siRNA-Dub3 組。當(dāng)匯合度達(dá)到60%時，使用LipofectamineTM2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。Blank 組細(xì)胞不進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot，WB）轉(zhuǎn)染48 h 后，取3 組細(xì)胞行常規(guī)WB 檢測［9］。一抗稀釋比例為：Dub3（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、claudin-1（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、snail（1∶500）、slug（1∶500）、twist（1∶500）、GAPDH（1∶3 000）。

1.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）轉(zhuǎn)染48 h 后，收集3 組細(xì)胞，Trizol 法提取總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Dub3 上游引物：5′-CTATCATTGCGGTCTTTGTCTCC-3′，下游引物：5′-AAGTGATGCTACAGGCAGTGA；GAPDH 上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC。2-ΔΔCt法計算Dub3的相對表達(dá)量［10］。

1.5 MTT 試驗轉(zhuǎn)染24 h 后，將3 組細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24、48和72 h后，加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h，加入150 μL的DMSO，震蕩5 min后，于450 nm波長下測定吸光度值（OD值）。

1.6 Transwell 試驗在侵襲試驗中，將20 μL的Matrigel 基質(zhì)膠鋪于Transwell的上室底部，其余步驟與遷移試驗相同。轉(zhuǎn)染24 h后，將含有6×104個細(xì)胞的200 μL懸液加入上室，下室中加入800 μL培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。取出小室，多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色30 min，蒸餾水沖洗。顯微鏡下（×100）計算細(xì)胞數(shù)量。

1.7 細(xì)胞免疫熒光染色轉(zhuǎn)染48 h 后，多聚甲醛固定20 min，5%的牛血清白蛋白封閉30 min，加入抗E-cadherin 抗體（1∶100）和抗N-cadherin 抗體（1∶100）4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌，加入二抗37 ℃孵育30 min，PBS 洗滌，加入DAPI 染色10 min，PBS洗滌后，熒光顯微鏡拍照（×200）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，多組計量數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，兩組間比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞的沉默效果與Blank 組和siRNA-Control 組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中Dub3 蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1、表1）。

圖1 WB 檢測Dub3 蛋白質(zhì)的表達(dá)情況Fig.1 WB was used to detect the protein expression of Dub3

表1 3 組細(xì)胞中Dub3 蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of the protein and RNA expression of Dub3 among three groups ±s

表1 3 組細(xì)胞中Dub3 蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)的比較Tab.1 Comparison of the protein and RNA expression of Dub3 among three groups ±s

注：與Blank組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control組相比，bP ＜0.05

組別Blank 組siRNA-Control 組siRNA-Dub3 組F 值P 值蛋白質(zhì)1.00±0.15 0.94±0.18 0.25±0.13ab 72.580＜0.001 mRNA 1.00±0.17 1.03±0.16 0.22±0.15ab 82.170＜0.001

2.2 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞增殖的影響與Blank 組和siRNA-Control 組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞在培養(yǎng)48 和72 h 時的OD值降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2、表2）。

圖2 MTT 試驗檢測細(xì)胞的增殖Fig.2 MTT test was used to detect the cell proliferation

表2 3 組細(xì)胞間細(xì)胞增殖的比較（OD 值）Tab.2 Comparison of cell proliferation among three groups（OD） ±s

表2 3 組細(xì)胞間細(xì)胞增殖的比較（OD 值）Tab.2 Comparison of cell proliferation among three groups（OD） ±s

注：與Blank組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control組相比，bP ＜0.05

組別Blank 組siRNA-Control 組siRNA-Dub3 組F 值P 值24 h 0.471±0.049 0.483±0.044 0.440±0.038 2.555 0.096 48 h 0.675±0.088 0.654±0.082 0.526±0.059ab 10.870＜0.001 72 h 0.916±0.095 0.907±0.091 0.725±0.083ab 14.400＜0.001

圖3 細(xì)胞免疫熒光染色檢測E-cadherin 和N-cadherin的表達(dá)（×200）Fig.3 Immunofluorescence staining was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin（×200）

2.3 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與Blank 組和siRNA-Control 組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞的E-cadherin 熒光強(qiáng)度升高，N-cadherin 熒光強(qiáng)度降低（圖3）。與Blank組和siRNA-Control 組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中E-cadherin、claudin-1 表達(dá)上升，N-cadherin、vimentin 表達(dá)降低（P＜0.05，圖4、表3）。

2.4 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響與Blank 組和siRNA-Control 組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中MMP2 和MMP9 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5、表4）。

2.5 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞遷移和侵襲的影響與Blank 組和siRNA-Control 組相比，siRNADub3 組細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖6、表5）。

2.6 siRNA-Dub3 對HepG2 細(xì)胞中snail、slug 和twist 表達(dá)的影響與Blank 組和siRNA-Control組相比，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中snail、slug 和twist表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖7、表6）。

圖4 WB 檢測EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)情況Fig.4 WB was used to detect the expression of EMT-related protein

3 討論

泛素化是控制眾多蛋白質(zhì)功能的關(guān)鍵機(jī)制，參與調(diào)節(jié)DNA 修復(fù)等生理過程［11］。蛋白質(zhì)的泛素化

是可逆的，去泛素化酶便是參與這一過程的關(guān)鍵酶，主要通過水解聚泛素鏈將泛素蛋白從靶蛋白上解離［12］。Dub3 是一種去泛素化酶，可通過調(diào)節(jié)Ras信號通路等機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖［3］。Dub3 在多種腫瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，如ZHOU 等［13］發(fā)現(xiàn)Dub3 在卵巢癌組織呈強(qiáng)陽性染色，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，是卵巢癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因子。但是，Dub3是否參與肝癌的進(jìn)展尚不清楚。

表3 3 組細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of the expression of EMT-related protein among three groups ±s

表3 3 組細(xì)胞中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Tab.3 Comparison of the expression of EMT-related protein among three groups ±s

注：與Blank組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control組相比，bP ＜0.05

組別Blank組siRNA-Control組siRNA-Dub3組F值P值E-cadherin 1.00±0.18 1.06±0.21 2.29±0.34ab 82.790＜0.001 claudin-1 1.00±0.19 0.97±0.18 2.76±0.41ab 133.200＜0.001 N-cadherin 1.00±0.21 1.02±0.17 0.55±0.23ab 16.830＜0.001 vimentin 1.00±0.16 0.95±0.20 0.47±0.21ab 23.420＜0.001

圖5 WB 檢測基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)情況Fig.5 WB was used to detect the expression of matrix metalloproteinase

表4 3 組細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of the expression of matrix metalloproteinase among three groups ±s

表4 3 組細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的比較Tab.4 Comparison of the expression of matrix metalloproteinase among three groups ±s

注：與Blank組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control組相比，bP ＜0.05

組別Blank 組siRNA-Control 組siRNA-Dub3 組F 值P 值MMP-2 1.00±0.21 1.07±0.25 0.49±0.16ab 22.750＜0.001 MMP-9 1.00±0.18 0.95±0.20 0.35±0.12ab 45.220＜0.001

表5 3 組細(xì)胞間遷移和侵襲的比較（n=10）Tab.5 Comparison of the migration and invasion among three groups ±s

表5 3 組細(xì)胞間遷移和侵襲的比較（n=10）Tab.5 Comparison of the migration and invasion among three groups ±s

注：與Blank 組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control 組相比，bP ＜0.05

組別Blank 組siRNA-Control 組siRNA-Dub3 組F 值P 值遷移185.23±13.40 177.52±11.61 59.15±7.63ab 402.200＜0.001侵襲92.47±9.13 98.65±8.06 51.30±6.22ab 106.300＜0.001

圖6 Transwell 試驗檢測細(xì)胞的遷移和侵襲（×100）Fig.6 Transwell assay was used to examine the migration and invasion（×100）

圖7 WB 檢測snail、slug 和twist的表達(dá)情況Fig.7 WB was used to detect the expression of snail，slug and twist

表6 3 組細(xì)胞中snail、slug 和twist 表達(dá)的比較Tab.6 Comparison of the expression of snail，slug and twist among three groups ±s

表6 3 組細(xì)胞中snail、slug 和twist 表達(dá)的比較Tab.6 Comparison of the expression of snail，slug and twist among three groups ±s

注：與Blank 組相比，aP ＜0.05；與siRNA-Control 組相比，bP ＜0.05

組別Blank 組siRNA-Control 組siRNA-Dub3 組F 值P 值snail 1.00±0.25 0.92±0.21 0.43±0.24ab 17.400＜0.001 slug 1.00±0.20 1.04±0.19 0.30±0.25ab 37.490＜0.001 twist 1.00±0.16 0.97±0.20 0.37±0.15ab 43.010＜0.001

本研究設(shè)計合成了Dub3的小干擾RNA，對HepG2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)，與Blank 組和siRNAControl 組相比較，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中Dub3 蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)降低，表明小干擾RNA 對Dub3的抑制效果較好。MTT 和Transwell 試驗結(jié)果顯示，與Blank 組和siRNA-Control 組相比較，siRNADub3 組細(xì)胞在培養(yǎng)48 和72 h 時的OD值降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量降低，表明Dub3 沉默可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接減弱，向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，獲得更強(qiáng)遷移能力，這一過程稱為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是肝癌細(xì)胞的重要病理表現(xiàn)［14］，本研究結(jié)果顯示Dub3 沉默可以促進(jìn)上皮標(biāo)志物的表達(dá)，降低間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，表明Dub3 沉默可以抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。基質(zhì)金屬蛋白酶的過度分泌在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中發(fā)揮重要作用［15］，Dub3 沉默可以抑制肝癌細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)，進(jìn)一步證實了Dub3 在肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中的關(guān)鍵作用。

Dub3 促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的主要機(jī)制可能是Dub3 與CDC25A、Snail 等致癌因子結(jié)合，阻止泛素化修飾，維持致癌因子的穩(wěn)定，如PEREG 等［16］在Dub3 敲低的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，CDC25A的降解增強(qiáng)，導(dǎo)致Cdk/cyclin 復(fù)合體的活性降低，細(xì)胞停滯于G1/S 期和G2/M 期。本研究結(jié)果顯示，與Blank 組和siRNA-Control 組相比較，siRNA-Dub3 組細(xì)胞中snail、slug 和twist的表達(dá)降低，表明Dub3 沉默可以下調(diào)snail、slug 和twist 表達(dá)，可能是抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制。

本研究的不足與展望：（1）本研究僅在細(xì)胞學(xué)水平對Dub3的生物學(xué)作用進(jìn)行了探討，但是體外細(xì)胞學(xué)實驗無法有效模擬體內(nèi)環(huán)境，下一步需要構(gòu)建動物模型驗證本研究結(jié)論；（2）Dub3 是否直接與snail、slug 和twist 等因子結(jié)合，并且促進(jìn)其穩(wěn)定，仍缺乏直接證據(jù)，下一步需要進(jìn)行蛋白相互作用等實驗進(jìn)行驗證。

綜上所述，Dub3 沉默可以抑制肝癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移和侵襲，可能與下調(diào)snail、slug和twist 表達(dá)有關(guān)。