一種用于“自頂向下” 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析的軟件及其在蛋白質(zhì)光解離質(zhì)譜中的應(yīng)用

周敏 石瑩瑩 張凱林 張先燚 孔祥蕾

摘要：隨著完整蛋白質(zhì)離子碎裂技術(shù)的發(fā)展及其在自頂向下（Top-down，TD）蛋白質(zhì)組學(xué)中的運(yùn)用，蛋白質(zhì)裂解的碎片質(zhì)譜可提供更加豐富的碎片信息，因此，開(kāi)發(fā)新的算法用于碎片離子的自動(dòng)分析，已經(jīng)成為自頂向下蛋白質(zhì)組學(xué)中非常重要的任務(wù)。本研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)應(yīng)用于分析自頂向下質(zhì)譜數(shù)據(jù)的軟件（NanKaiTop-Down，NKTD），其主要特點(diǎn)是采用“由一到多”式的尋找同位素峰簇的方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)重疊譜峰的自動(dòng)解析。算法對(duì)已識(shí)別離子進(jìn)行數(shù)據(jù)后處理和分析的結(jié)果有利于研究蛋白質(zhì)離子在不同碎裂技術(shù)下產(chǎn)生的碎片離子信息。利用此軟件對(duì)泛素蛋白離子在紅外多光子解離（IRMPD）和紫外光解離（UVPD）兩種裂解方法下的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，泛素蛋白離子在UVPD方法下產(chǎn)生的碎片離子種類非常豐富，其裂解位點(diǎn)覆蓋率也遠(yuǎn)優(yōu)于IRMPD方法。更為重要的是，在自頂向下質(zhì)譜學(xué)中，這兩種裂解方式具有良好的互補(bǔ)性。

關(guān)鍵詞：自頂向下;蛋白質(zhì);譜峰識(shí)別;紅外多光子解離;紫外光解離

1引言

電噴霧電離（Electro-sprayionization，ESI）[1]和基質(zhì)輔助激光解吸附電離（Matrix-assistedlaserdesorptionandionization，MALDI）[2]技術(shù)的發(fā)明使得生物質(zhì)譜進(jìn)入一個(gè)全新的時(shí)代，也使蛋白質(zhì)組學(xué)研究得到了快速發(fā)展。在蛋白組學(xué)研究中，使用最為廣泛的是“自底向上（Bottom-up，BU）”的策略[3，4]，即將蛋白質(zhì)復(fù)雜樣品的酶切產(chǎn)物通過(guò)色譜進(jìn)行分離后，再利用質(zhì)譜并結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，實(shí)現(xiàn)肽段和蛋白質(zhì)的鑒定。與BU策略互補(bǔ)的一項(xiàng)技術(shù)是“自頂向下（Top-down，TD）”策略，以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的“自中向下（Middle-down，MD）”方法[5，6]。其中，自頂向下方法是直接將完整的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和離子化，然后在氣相中利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)將其裂解，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定以及翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定。隨著高分辨質(zhì)譜技術(shù)及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，以及TD方法的準(zhǔn)確性和獨(dú)特性，這種策略在近年逐漸成為蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)研究的熱點(diǎn)[7～16]。

自頂向下質(zhì)譜技術(shù)現(xiàn)已在蛋白質(zhì)鑒定中占有非常重要的地位。在此類工作中，通過(guò)算法自動(dòng)解析質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的鑒定，已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的熱點(diǎn)。因此，許多研究人員和商業(yè)公司開(kāi)發(fā)了許多優(yōu)秀的算法和程序，如：ProSight[17，18]、MS-TopDown[19]、TopPIC[20]、MASHsuite[21]、MSpathFinder[22]、Ptop[23]、CUDA-TP[24]、SQID[25]、Sequest[26]、Mascot[27]、OMMSA[28]、ProVerB[29]、RT-PSM[30]等。這些算法多基于實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜與現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論譜進(jìn)行匹配，通過(guò)打分函數(shù)進(jìn)行評(píng)判，將分值最高的、匹配度最好的理論譜對(duì)應(yīng)的候選片段認(rèn)定為該實(shí)驗(yàn)圖譜對(duì)應(yīng)的最佳結(jié)果。這些算法的實(shí)現(xiàn)，對(duì)蛋白質(zhì)鑒定和分析起到了極大的促進(jìn)作用，大大節(jié)省了相關(guān)科研工作者的時(shí)間和精力。

另一方面，在自頂向下的蛋白質(zhì)組學(xué)中，為了更有效地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子的裂解，研究者開(kāi)發(fā)了多種蛋白質(zhì)分子串聯(lián)質(zhì)譜的方法，如低能碰撞誘導(dǎo)解離（Collisioninduceddissociation，CID）[31]、電子捕獲裂解（Electroncapturedissociation，ECD）[32，33]、電子轉(zhuǎn)運(yùn)裂解（Electrontransferdissociation，ETD）[34]、高能碰撞裂解（High-energydissociation，HCD）[35]、紅外多光子解離（Infraredmultiphotondissociation，IRMPD）[36]、紫外光解離（Ultravioletphotodissociation，UVPD）等。這些質(zhì)譜技術(shù)在“自頂向下”的蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用，使得蛋白質(zhì)離子裂解后產(chǎn)生大量的、種類豐富的碎片離子。為了能夠理解這些碎片離子種類、碎裂時(shí)的序列覆蓋率以及其它信息（如氣相中蛋白質(zhì)離子的構(gòu)象及構(gòu)象變化），許多課題組研發(fā)了相應(yīng)的算法和軟件，以實(shí)現(xiàn)對(duì)這些碎片離子的鑒定和數(shù)據(jù)分析，如THRASH算法[37]、Decon2LS[38]、DeconMSn[39]、MS-Deconv[40]。其中，Horn等[37]開(kāi)發(fā)的THRASH算法現(xiàn)已被廣泛運(yùn)用在很多軟件中，成為目前主流的自頂向下質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理算法之一。該算法采用減法式譜峰發(fā)現(xiàn)的方法尋找可能的同位素峰。Jeon等[41]也對(duì)這一算法進(jìn)行改進(jìn)，使得其運(yùn)行速度得到了提升。盡管如此，由于碎片離子的多樣性以及普遍存在的譜峰重疊的情況，此類算法在重疊峰的處理中仍不夠理想。在處理重疊峰的眾多算法中，“同位素輪廓指紋比對(duì)”算法利用比例配分的方法能夠較準(zhǔn)確地解析出重疊峰，但其速度較慢;田志新課題組發(fā)明了一種生物質(zhì)譜重疊同位素輪廓的解析方法，該方法以參與重疊的離子的理論同位素輪廓中無(wú)重疊的最高峰作為參考峰，對(duì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)同位素輪廓中每個(gè)同位素峰的實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，因此該方法的計(jì)算量小、通量高、準(zhǔn)確度高[42～46]，但在處理離子同位素全部重疊的情況下，該算法的處理效果就會(huì)稍弱一些。另外，已有的程序中，對(duì)復(fù)雜碎片離子的數(shù)據(jù)分析仍不夠充分，影響了對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的充分解讀。基于此，本研究開(kāi)發(fā)了NanKaiTop-Down（NKTD）應(yīng)用程序，有效地解析了質(zhì)譜圖中的重疊峰，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的分析和挖掘。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

配有電噴霧離子源的7.0TIonSpec型傅里葉變換離子回旋共振（Fouriertransformioncyclotronresonance，F(xiàn)T-ICR）質(zhì)譜儀（美國(guó)Varian公司）;光學(xué)參量振蕩（Opticalparametricoscillator，OPO）Firefly-IR型紅外激光器（英國(guó)MSquared公司）;波長(zhǎng)為193nm的ExcimerLasersSeriesCL5300型準(zhǔn)分子激光器（俄羅斯Optosystems公司）;SSH-R型機(jī)械快門（日本Sigma-Koki公司）。

甲醇（色譜純，百靈威科技有限公司）;乙酸（98%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;牛泛素蛋白（Bovineubiquitin，98%，Sigma-Aldrich公司）;實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制備。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1樣品制備牛泛素蛋白未經(jīng)過(guò)進(jìn)一步提純，采用水-甲醇-乙酸（49∶49∶2，V/V）溶液配制成1μmol/L牛泛素蛋白溶液。

2.2.2FT-ICR高分辨質(zhì)譜將已經(jīng)制備好的牛泛素蛋白樣品溶液以120μL/h的速度注入進(jìn)電噴霧離子源，并通過(guò)電噴霧電離產(chǎn)生帶有不同電荷的牛泛素蛋白離子。FT-ICR質(zhì)譜儀通過(guò)存儲(chǔ)波表逆傅里葉變換（StoredwaveforminverseFouriertransform）的方法[47]，將目標(biāo)離子選定在質(zhì)譜儀器的分析池中，再分別將OPO紅外激光器產(chǎn)生的紅外激光和準(zhǔn)分子激光器產(chǎn)生波長(zhǎng)為193nm的紫外激光引入到分析池中，并設(shè)定機(jī)械快門控制激光照射目標(biāo)離子的時(shí)間為8s，記錄光解離質(zhì)譜。

3算法設(shè)計(jì)

NKTD程序基于MATLAB軟件平臺(tái)編寫(xiě)，質(zhì)譜數(shù)據(jù)以ASCII數(shù)據(jù)格式（分別按離子的質(zhì)荷比及相應(yīng)的強(qiáng)度值）被程序讀入。程序主要由4個(gè)模塊組成，分別為：數(shù)據(jù)庫(kù)建立、譜峰識(shí)別、譜峰匹配和數(shù)據(jù)分析。整個(gè)程序的流程如圖1所示。

3.1數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

在用戶輸入目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列，以及離子所帶的電荷范圍之后，程序會(huì)首先讀取氨基酸序列，依據(jù)用戶所設(shè)定的離子電荷范圍搭建此蛋白質(zhì)碎裂產(chǎn)生的所有可能的a，b，c，x，y，z以及其它相關(guān)離子的分子式[48]，再?gòu)倪@些離子的分子式中分別讀取離子所含元素（如C，H，O，N，S等）的數(shù)目，最終將這些元素?cái)?shù)目代入元素同位素質(zhì)量分布數(shù)據(jù)庫(kù)[49]中進(jìn)行組合，建立離子同位素峰簇質(zhì)量分布數(shù)據(jù)庫(kù)。用戶也可根據(jù)可能的翻譯后修飾，或其它特殊要求自行對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)充。

3.2實(shí)驗(yàn)譜峰尋找

在THRASH算法中，對(duì)實(shí)驗(yàn)譜峰的搜尋是基于計(jì)算出較合理的譜峰信噪比[37]，但這種方法的弊端是：若計(jì)算得到的信噪比過(guò)大，則會(huì)減少識(shí)別實(shí)驗(yàn)譜峰信號(hào)的數(shù)目，相反則會(huì)將部分噪聲信號(hào)識(shí)別成實(shí)驗(yàn)譜峰信號(hào)。為了避免計(jì)算出不合理的信噪比，NKTD不采用計(jì)算譜峰信噪比的方法，而是采用計(jì)算實(shí)驗(yàn)譜峰的背景噪聲，用戶設(shè)定信噪比閾值的方法[50]：（1）以1m/z大小的窗口，每次移動(dòng)0.5m/z步長(zhǎng)，對(duì)輸入的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行掃描，并且在每個(gè)窗口中對(duì)數(shù)據(jù)求平均值;（2）每10個(gè)窗口（用戶可定義）之間，平均值最小的窗口認(rèn)定為噪聲窗口;（3）將噪聲窗口中的強(qiáng)度值繪制成直方圖。為了消除譜峰信號(hào)或射頻信號(hào)的高度對(duì)判斷噪聲峰值引起的干擾，當(dāng)直方圖中最小值小于最大值的5%時(shí)，該最大值的直方圖被舍棄;再將最小值與次最大值比較，若小于次最大值的5%，則該次最大值被舍棄;依此處理，直至剔除所有可能含有譜峰信號(hào)或射頻信號(hào)的直方圖，再對(duì)余下的進(jìn)行求均值，最終認(rèn)定該均值為噪聲。

以泛素蛋白在UVPD下m/z846.4～847.8區(qū)間內(nèi)的實(shí)驗(yàn)碎片質(zhì)譜峰（圖2A）為例，在得到噪聲值后，逐點(diǎn)掃描實(shí)驗(yàn)碎片質(zhì)譜數(shù)據(jù)，當(dāng)該數(shù)據(jù)點(diǎn)大于用戶定義的信噪比值，則將該數(shù)據(jù)點(diǎn)輸出，輸出的數(shù)據(jù)點(diǎn)為譜峰的剖面式信號(hào)（圖2B），隨后程序會(huì)對(duì)剖面式信號(hào)值進(jìn)行中心化，求出每個(gè)譜峰的峰值（圖2C中黑色中心線所示）。

3.3譜峰匹配

為實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)中觀察到的離子進(jìn)行指認(rèn)和分類，NKTD程序?qū)?shí)驗(yàn)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論預(yù)測(cè)譜峰進(jìn)行比對(duì)，對(duì)滿足匹配要求的譜峰打分，再將分值高的理論譜峰選出，若滿足閾值，則認(rèn)定為對(duì)應(yīng)的離子。其中打分函數(shù)的設(shè)定顯得尤為重要，同時(shí)打分函數(shù)需要通過(guò)不斷地修正才能給出更合理的置信水平。高分辨實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)中獲得的是離子同位素分布信息，其包含離子的質(zhì)荷比信息以及對(duì)應(yīng)的強(qiáng)度信息。此算法從離子的質(zhì)荷比信息出發(fā)，結(jié)合其強(qiáng)度信息，采用“由一到多”式的譜峰相減，再組合打分的方法，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)中觀察到譜峰與數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)期離子理論譜峰的匹配。此算法對(duì)重疊峰進(jìn)行分析的具體過(guò)程如下及示意圖（圖3）所述：（1）NKTD對(duì)實(shí)驗(yàn)譜峰進(jìn)行識(shí)別后，得到的是實(shí)驗(yàn)譜峰的峰值數(shù)據(jù)點(diǎn)，包含離子的質(zhì)荷比信息（me）及強(qiáng)度信息（Ie）（圖3A）;（2）算法依次將實(shí)驗(yàn)譜峰中峰值數(shù)據(jù)點(diǎn)的質(zhì)荷比（mei）與已經(jīng)建立好的離子同位素質(zhì)量分布數(shù)據(jù)庫(kù)中最高豐度的單同位素峰的質(zhì)荷比（mti）進(jìn)行求差，得到di，若di的絕對(duì)值滿足已經(jīng)設(shè)定好的閾值D（默認(rèn)設(shè)置為0.02，但用戶可改），則將該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)認(rèn)定為“一”，再分別向該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)的左右兩個(gè)方向?qū)ふ以撾x子的同位素峰簇，尋找到的離子同位素峰簇則認(rèn)定為“多”，如圖3B中紅色的中心線所示（NKTD匹配到了理論值為T1離子）：

3.4數(shù)據(jù)處理

基于前3個(gè)模塊的數(shù)據(jù)預(yù)處理，軟件對(duì)已經(jīng)識(shí)別出的離子按照要求進(jìn)行分類和相關(guān)的數(shù)據(jù)分析。主要內(nèi)容有：離子歸類、裂解位點(diǎn)分析、質(zhì)子化位點(diǎn)分析等。以下將以＼[Ubiquitin+10H]10+的紅外光解離和紫外光解離質(zhì)譜為例，對(duì)碎片離子的種類、裂解位點(diǎn)及質(zhì)子化位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.5軟件操作界面

NKTD1.0版本的用戶操作界面基于MATLAB軟件進(jìn)行GUI編程開(kāi)發(fā)，其操作界面如圖4所示，主要分為菜單欄、參數(shù)設(shè)置區(qū)、功能按鈕區(qū)、顯示區(qū)及作圖區(qū)。由于該軟件目前只支持在正離子模式下對(duì)已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)（或多肽）在不同裂解方式下產(chǎn)生碎片離子的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析，因此，在文后支持信息中以解析帶有11價(jià)正電荷的泛素蛋白離子在波長(zhǎng)為193nm的紫外激光照射條件下產(chǎn)生的碎片離子質(zhì)譜圖為例，對(duì)軟件的操作步驟及功能進(jìn)行詳細(xì)介紹。

4結(jié)果與討論

蛋白質(zhì)光解離技術(shù)在近年來(lái)得到了快速的發(fā)展。早期的自頂向下蛋白質(zhì)光解離主要使用的是CO2激光器[51]，其裂解產(chǎn)生的碎片離子種類與使用CAD裂解方法產(chǎn)生的離子種類基本一致，均為b，y離子，這一事實(shí)與能量在蛋白質(zhì)離子中吸收再分配相一致[52]。Brodbelt的研究所用193nm的紫外激光器致使蛋白質(zhì)離子發(fā)生裂解，且觀察到更為豐富的碎片離子[53，54]。

4.1碎片質(zhì)譜解析

本研究利用紅外多光子解離（IRMPD）[55]、紫外光解離（UVPD）的蛋白質(zhì)碎裂技術(shù)，分別對(duì)＼[Ubiquitin+10H]10+進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)此軟件對(duì)其碎片離子質(zhì)譜進(jìn)行解析，得到的碎片離子分布如圖5所示，IRMPD產(chǎn)生的碎片離子種類較UVPD少。為了進(jìn)一步研究IRMPD與UVPD產(chǎn)生碎片離子種類的區(qū)別，利用NKTD軟件對(duì)兩張碎片離子質(zhì)譜圖進(jìn)行了詳細(xì)的數(shù)據(jù)分析。

4.2碎片質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

兩種方法所產(chǎn)生的碎片離子的種類分布如圖6所示，IRMPD產(chǎn)生的碎片離子種類為b和y離子，與廣泛使用的CAD方法一致。但其中b和y離子的分布并不均等，分別占36%和64%。即觀察到的y離子種類比b離子種類高約70%。另一方面，UVPD產(chǎn)生的碎片離子種類豐富且整體分布較均勻。其中a與x離子的分布非常接近，分別為19%和20%。c與z離子的分布也有類似的趨勢(shì)，分別為16%和14%。但b與y離子分布差距稍大，分別為14%和17%。

NKTD程序按照離子種類在不同氨基酸序列位點(diǎn)對(duì)其所帶電荷數(shù)目進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而得到如電子版文后支持信息圖S6所示的離子在不同位點(diǎn)所帶質(zhì)子數(shù)目的信息。此信息有助于理解氣相蛋白質(zhì)正離子的質(zhì)子分布以及所映射出的結(jié)構(gòu)信息[48]。更為重要的是，對(duì)碎片離子的進(jìn)一步分析可以直觀地得到目標(biāo)蛋白離子分別在IRMPD和UVPD條件下發(fā)生斷裂的氨基酸序列位點(diǎn)。如電子版文后支持信息圖S7所示，在IRMPD下泛素蛋白發(fā)生斷裂的氨基酸序列位點(diǎn)明顯比在UVPD下發(fā)生的斷裂位點(diǎn)少，對(duì)應(yīng)的10個(gè)斷裂位點(diǎn)分別為10、18、24、26、27、28、37、39、52、58。碎片的序列覆蓋率僅為13%，與CAD的結(jié)果基本一致。而利用UVPD技術(shù)則可更好地實(shí)現(xiàn)“自頂向下”的蛋白質(zhì)碎裂，序列覆蓋率>76%。深入比較可以發(fā)現(xiàn)，UVPD碎片譜中發(fā)生序列缺失的第10、24、26、27、58號(hào)位點(diǎn)，正是IRMPD技術(shù)中的裂解位點(diǎn)。此結(jié)果揭示了IRMPD或CAD技術(shù)與UVPD技術(shù)在蛋白質(zhì)分子裂解過(guò)程的差別以及互補(bǔ)性，為設(shè)計(jì)更有效的自頂向下的蛋白質(zhì)組學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段提供了新思路。

5結(jié)論

為滿足基于自頂向下技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求，本研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)自動(dòng)分析和處理已知序列蛋白質(zhì)分子的碎裂質(zhì)譜數(shù)據(jù)的程序NKTD。在對(duì)實(shí)驗(yàn)譜峰進(jìn)行識(shí)別的過(guò)程中，NKTD采用了“由一到多”的譜峰相減再組合打分的方法，較好地實(shí)現(xiàn)了重疊譜峰的自動(dòng)解析，減少了人工干預(yù)。利用NKTD程序進(jìn)一步對(duì)泛素蛋白離子在IRMPD（2990nm）和UVPD（193nm）實(shí)驗(yàn)中所獲得的光解離碎片質(zhì)譜進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，IRMPD方法中產(chǎn)生的主要是b，y系列的碎片離子，而UVPD方法產(chǎn)生的碎片離子種類非常豐富且整體分布較為均勻，裂解位點(diǎn)覆蓋率也遠(yuǎn)優(yōu)于IRMPD的結(jié)果。兩種方法在裂解方式上的不同使得它們具有非常好的互補(bǔ)性。NKTD程序的數(shù)據(jù)分析能夠更直觀地展示出完整蛋白質(zhì)離子在不同碎裂方法下的裂解情況，有利于進(jìn)一步理解相關(guān)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。另一方面，NKTD程序的算法和數(shù)據(jù)分析還需進(jìn)一步改進(jìn)，并在蛋白質(zhì)翻譯后修飾、氫氘交換位點(diǎn)、氧化位點(diǎn)確認(rèn)等實(shí)際數(shù)據(jù)分析中發(fā)揮作用。

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