上海春季大氣顆粒物中致敏懸鈴木花粉蛋白的分布特征

趙 慧, 彭加仙, 洪 強, 張紅莉, 王偉倩, 王青躍,譚正瑩, 周樹敏, 張 衛, 呂森林

(1. 上海大學環境與化學工程學院, 上海200444; 2. 上海大學生命科學學院, 上海200444;3. 日本埼玉大學大學院理工學研究科, 埼玉338-8570)

近年來, 隨著城市綠化面積的增加和植物種類的增多, 人群中花粉過敏的就診率也在逐年遞增. 花粉癥的發病率升高, 已成為全球性的問題. 在國內, 花粉癥患者在人群中的發病率約為0.5%～1.0%, 最高的發病地區可達5%[1]. 研究表明, 花粉是誘發季節性過敏性鼻炎和哮喘的主要原因[2]. 在外部因素的作用下, 花粉內部的細顆粒物(subpollen particles, SPPs)會被釋放出來[3], 長期懸浮在環境中, 成為PM2.5的一部分, 對人群健康產生影響. 資料顯示, 懸鈴木屬植物花粉是我國主要的致敏花粉[4], 其致敏蛋白主要包括Pla a1, Pla a2 和Pla a3, 其中Pla a3 屬于非特異性的糖蛋白脂質轉移蛋白[5-7]. 作為城市道路景觀樹, 懸鈴木在上海市分布廣泛, 其花粉已經成為上海市春季主要的致敏原[8-9]. 本工作選擇上海大氣顆粒物中致敏懸鈴木花粉蛋白Pla a3 為研究對象, 利用生物工程手段表達Pla a3 蛋白, 并使用該致敏蛋白免疫大鼠, 獲取單一致敏原的抗體, 利用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 檢測分析上海市大氣顆粒物中Pla a3 蛋白的分布特征. 這一研究工作不僅可以為今后進一步制備單抗及基因工程生產花粉變應原奠定基礎, 提高過敏性哮喘病的診治水平, 還可以為上海城鎮綠化植物的合理選擇和配置提供重要的參考依據.

1 材料與方法

1.1 大氣顆粒物采集

本工作采集了上海2017 年春季的大氣顆粒物, 使用日本柴田公司SIBATA 五級大流量采樣器采集大氣顆粒物. 采集前, 將石英膜在馬弗爐(450?C)中焙燒4 h, 在恒溫恒濕箱中以25?C 溫度和50%濕度條件放置24 h, 用電子天平準確稱重, 然后用干凈的鋁箔紙包裹, 放置在-4?C 的冰箱中保存[10]. 采樣地點在上海大學寶山校區南門, 采樣高度為1.5 m, 每次采樣周期為48 h. 采樣器能將大氣中的顆粒物根據空氣動力學直徑分別采集到5 張石英濾膜上, 工作流速為566 L/min, 五級的切割粒徑分別為＞7.0, 3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0, ＜1.1μm. 采樣結束后, 濾膜用鋁箔紙包裹好, 恒溫恒濕24 h 后稱重, 然后密封包裝于-20?C 的冰箱中冷凍保存, 以待分析測試.

1.2 抗體制備

克隆懸鈴木花粉變應原蛋白Pla a3 的編碼序列(coding sequence, CDS), 構建到原核表達載體Pet-32a 中并轉化大腸桿菌Rosetta 菌株, 在28?C 條件下經異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)誘導表達蛋白, 并進行純化. 利用純化后的Pla a3 重組蛋白免疫注射SD 大鼠, 然后利用懸鈴木花粉浸取液混合Pla a3 重組蛋白對大鼠進行霧化處理[11-12]. 最后, 獲取致敏大鼠血清并對其中所含抗體的特異性及其效價進行鑒定. 鑒定結果顯示, 本工作獲得了特異性良好、高效價的IgE 抗體, 可用于后續檢測分析上海大氣顆粒物中懸鈴木花粉致敏蛋白Pla a3 的分布特征.

1.3 總蛋白測定

本工作采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒(增強型, 上海翊圣生物科技有限公司, 中國)測定大氣顆粒物中的總蛋白質量濃度. 二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid, BCA)是目前應用比較廣泛的蛋白質濃度測定方法. 基于雙縮脲反應, 即在堿性條件下蛋白質將Cu2-還原成Cu-, 產生一種紫藍色復合物, 在562 nm 處有高的吸光值. 該反應物的量與蛋白質濃度成正比. 具體操作步驟如下.

步驟1 預處理: 取1/8 采集顆粒物的濾膜, 用6 mL 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)浸 泡6 h; 將 所 得 溶 液 在4?C, 5 000 r/min 條 件 下 離 心20 min, 然后經0.45μm 過濾器過濾[13]后;再用真空濃縮儀(Eppendorf AG,德國)濃縮濾液到2 mL,-20?C 保存備用.

步驟2 比色皿檢測: 各取0.1 mL 標準品和待測樣品加入反應管中, 每管加入2.0 mL BCA 工作液, 混勻, 37?C 孵育30 min.

步驟3 冷卻至室溫, 在分光光度計上進行檢測. 設定波長為562 nm, 在10 min 內對所有樣品讀數.

1.4 ELISA

ELISA 是指利用抗原與抗體的特異反應, 將待測物與酶連接, 然后通過酶與底物產生顏色反應, 用于抗原與抗體結合狀況的定量測定. 具體操作步驟如下.

步驟1 預處理: 取1/8 采集顆粒物的濾膜, 用6 mL 的PBS 緩沖液浸泡6 h; 將所得溶液在4?C, 5 000 r/min 條件下離心20 min, 然后經0.45μm 過濾器過濾后; 再用真空濃縮儀濃縮濾液到2 mL, -20?C 保存備用.

步驟2 包被: 取96 微孔板, 每個反應孔中加100 μL 待測樣品濃縮液(重復3 個孔),4?C 避光孵育16 h, 以空白膜提取液為空白對照. 孵育結束后用PBST 洗滌液(加入0.5%Tween-20 的PBS 溶液)沖洗3 次, 每次5 min.

步驟3 封閉: 每孔加5%的脫脂奶粉溶液, 注滿后37?C 靜置1.5 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟4 孵育一抗: 加100μL 大鼠血清(1∶50), 37?C 避光孵育1.5 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟5 孵育酶標二抗: 加100μL 過氧化物酶標記的IgE 二抗(1∶10 000),37?C 避光孵育1 h 后洗滌, 洗滌條件同步驟2.

步驟6 加底物顯色液: 加入TMB 底物顯色液200μL, 37?C 避光孵育20 min.

步驟7 終止反應: 加2 mol/L H2SO450μL 終止反應. 利用酶標儀檢測OD450吸收值, 通過比對標準曲線估算被測樣品中變應原蛋白的質量濃度.

2 結果與討論

2.1 上海春季大氣顆粒物的粒徑分布

由圖1 可以看出, 2017 年春季采樣期間, 粒徑＞7 μm 的大氣顆粒物的質量濃度為60～65μg/m3, 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0μm 的3 個粒徑段的大氣顆粒物的質量濃度較為接近,粒徑＜1.1μm 的大氣顆粒物的質量濃度為35～55μg/m3. 與上海市環境保護局發布的空氣質量月報相比(http://www.sepb.gov.cn/fa/cms/xxgk//AC46/AC4602000/2017/05/96124.htm),PM2.5的質量濃度大體一致, 但是粗顆粒的濃度有明顯變化, 其中本研究樣品中粗顆粒物的比例較高. 這可能是因為本次采樣為地表采樣, 受到了地表揚塵的影響. 在＞7.0,3.3～7.0, 2.0～3.3μm 這3 個較大粒徑段內的顆粒物質量濃度在四月都有所升高, 但是1.1～2.0,＜1.1μm 小粒徑段內的顆粒物質量濃度并沒有升高. 這可能是由于四月份有一次沙塵天氣, 導致了空氣中粗顆粒物的增加[14]. 同時這也說明細顆粒物是上海主要的大氣污染物, 這與本課題組以往的研究結果相符[15-16].

圖1 2017 年上海春季大氣顆粒物樣品的質量濃度Fig.1 Mass concentrations of atmospheric particulate matter in the spring of Shanghai, 2017

2.2 大氣顆粒物中總蛋白的粒徑分布

從圖2 中可以看出, 在粒徑最小(＜1.1 μm)的顆粒物中, 總蛋白的平均質量濃度為2.5～3.0 μg/m3, 且在整個采樣期內總蛋白的質量濃度最大值為4.8 μg/m3. 由圖1 和2 可以計算得到: 總蛋白占大氣顆粒物的2.5%～5.6%; 所有粒徑段的總蛋白的平均質量濃度為6.26 μg/m3, 顆粒物的平均質量濃度為176.38 μg/m3. 因此, 總蛋白質量濃度在顆粒物中的平均比例為3.55%. 而且2017 年4 月6 日所采集到的樣品中的總蛋白主要集中在＞7.0 μm 粒徑段. 這可能與當日的天氣情況有關, 因為降雨而導致細顆粒中的蛋白質量濃度偏低. Kang等[17]的研究發現, 合肥地區的PM10中, 總蛋白來源主要有花粉、霉菌、細菌、真菌、孢子、昆蟲糞便、皮屑等, 平均質量濃度為11.42 μg/m3, 且蛋白質量濃度與降水量呈反比關系. 本研究中總蛋白質量濃度及其日變化同樣符合這一規律.

圖2 大氣顆粒物中總蛋白的粒徑分布Fig.2 Size distributions of the total protein in atmospheric particulate matter

2.3 大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的粒徑分布

本研究采用標準曲線法定量大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的質量濃度. 每次實驗都以相同的純化的rPla a3 蛋白為標樣, 以50, 100, 200, 500, 1 000, 2 000 pg/mL 質量濃度梯度繪制標準曲線, 以此來測定顆粒物內Pla a3 的質量濃度. 由圖3 可見: 大氣顆粒物中的致敏蛋白Pla a3 主要集中在＞7.0 μm 的粒徑段內, 其平均質量濃度為7.5 pg/m3, 而且在此粒徑段內, 呈現先增多后降低的時間變化趨勢, 與懸鈴木的花期相吻合; 在3.3～7.0, 2.0～3.3, 1.1～2.0μm 這3 個粒徑段內, Pla a3 蛋白的質量濃度相差不大, 約為1.8 pg/m3; 在＜1.1μm 的粒徑段內, Pla a3 蛋白的質量濃度最低, 約為0.5 pg/m3. 由圖2 和3 計算得到, Pla a3 蛋白占總蛋白的0.14%～0.29%. Fern′andez-Gonz′alez 等[18]的研究結果顯示, 在西班牙奧倫塞市的大氣中發現了懸鈴木花粉致敏蛋白Pla a1 的存在, 而在2013 年3 月28 日檢測到的Pla a1 蛋白的日最大質量濃度為1.2 ng/m3. 同時該研究還發現, 大氣中Pla a1 致敏蛋白的質量濃度與當地的平均溫度和最高溫度成正相關, 與相對濕度呈負相關. 而在本工作中, 檢測到大氣中致敏蛋白Pla a3 的日平均質量濃度為15 pg/m3, 遠低于致敏蛋白Pla a1 的質量濃度. 這可能是因為懸鈴木花粉中Pla a3 蛋白的表達量遠低于Pla a1 蛋白的表達量. 通過建立甄別大氣中Pla a3 致敏蛋白的質量生物學模型, 測定大氣中Pla a3 致敏蛋白的質量濃度水平, 可以為預防花粉癥及過敏性哮喘病提供一定的數據支持.

圖3 大氣顆粒物中致敏蛋白Pla a3 的粒徑分布Fig.3 Size distributions of Pla a3 protein in atmospheric particulate matter

3 結 論

(1) 采樣期間, 大氣顆粒物中的總蛋白主要集中在＜1.1μm 的粒徑段, 總蛋白質量濃度約為2.5～3.0μg/m3. 顆粒物中的致敏蛋白Pla a3 主要集中在＞7.0μm 的粒徑段, 平均質量濃度為8.7 pg/m3, 其時間變化趨勢與懸鈴木在花期釋放特征相吻合.

(2) 在總蛋白集中分布的粒徑段(＜1.1μm)內, 致敏蛋白Pla a3 的質量濃度最低. 這可能是因為細顆粒物中含有更多孢子、真菌等生物, 貢獻了其蛋白. 對于細顆粒物中其他致敏蛋白的分布特征, 還有待進一步研究.