O3氧化黑碳對SH-SY5Y 細胞的毒性作用

尚 羽, 王田田, 吳美英, 王 璐, 何慧心, 安 靜

(上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所, 上海200444)

由燃燒排放的BC 顆粒呈蓬松狀,比表面積大,具有很強的吸附能力,極易吸附大氣中的污染物質, 包括重金屬、多環芳烴、多氯聯苯、二英、多溴聯苯醚等[7]. 大氣中BC 顆粒的粒徑范圍變化較大,從幾個納米到幾個微米.粒徑小于100 nm 的超細BC 顆粒物可以通過人類呼吸道進入肺組織, 然后通過肺泡上皮細胞進入血液循環, 甚至進入其他器官組織, 例如肝臟等[8].對木材和柴油燃燒產生的顆粒進行毒理學研究發現, 顆粒物表面吸附的有機物, 如PAHs 和水溶性有機物等, 是這些顆粒物產生毒性效應的直接原因, 而燃燒產生的BC 顆粒只作為這些有機物的載體[9-10]. 新鮮排放的BC(fresh BC, FBC)顆粒可被大氣氧化劑(如O3, NOx等)氧化, 其表面理化特征和吸附化學物質都將發生改變. 如何表征大氣氧化過程對BC 顆粒物化性質及健康影響的作用, 成為近年該領域重點的關注內容.

使用商品化的納米級BC 顆粒為模型, 通過體內外的動物和細胞研究發現, BC 顆粒可直接造成生物體肺組織和細胞的損傷[11]. 除呼吸系統外, BC 顆粒還能誘發血管內皮細胞毒性和炎癥反應[12]. 動物實驗發現, 納米級BC 顆粒暴露可長期活化小鼠大腦內星形膠質細胞, 進而誘發退行性神經系統疾病[13]. 研究在體外培養的星形膠質細胞體系, 發現BC 顆粒可以通過激活連接蛋白通道, 誘導谷氨酸鹽和ATP 的釋放[14]. 這些研究都說明, BC 顆粒具有神經系統毒性, 但其具體的致毒機制尚未明確.

由于BC 顆粒在大氣中的氧化過程比較復雜, 因此關于BC 顆粒經O3氧化后, 其細胞毒性如何發生變化, 目前尚沒有定論[15]. 本工作以人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y 作為細胞模型, 探討經O3氧化過的BC(O3-oxidized BC, OBC)顆粒對神經細胞的毒性作用;應用MTT 方法測定細胞存活率, 探討OBC 顆粒對細胞增殖能力的影響; 利用乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LHD)漏出率表征細胞膜的損傷程度; 利用流式細胞術評估細胞凋亡比例; 通過熒光探針測定細胞內Ca2+濃度. 本工作以期為深入探討BC 顆粒的神經毒性, 解釋大氣中BC 顆粒對健康的影響提供基礎實驗數據.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

SH-SY5Y 為人神經母細胞瘤細胞, 來源于1970 年建立的神經母細胞瘤患者的轉移骨瘤細胞SK-N-SH 經3 次克隆后的亞系, 購自美國模式培養物集存庫. 納米級BC 顆粒(Printex U, 粒徑30 nm)可以非常好地模擬柴油燃燒排放的焦炭物質[16], 購自Degussa 公司(德國),按照文獻[17]的方法進行O3氧化, 獲得OBC 顆粒, 氧化過程保持O3濃度為0.01%. 反應時間為120 min. DMEM 購自HyClone 公司(美國). 胎牛血清購自PAA laboratories GmbH 公司(奧地利). LDH 試劑盒, 購自南京建成生物技術有限公司. 細胞培養板、培養皿和培養瓶均購自康寧公司(Corning, 美國). 其他試劑(分析純)購自上海國藥集團化學試劑公司.

本工作所用儀器如下: 正置熒光顯微鏡(BX51 型, Olympus 公司, 日本); iMark-680 型酶聯免疫檢測儀(BIO-RAD公司, 美國); 高速分選型流式細胞儀(Beckman coulterter, 香港); 倒置生物顯微鏡(Olympus, CKX41, 日本); CO2恒溫細胞培養箱(Binder 公司, 德國).

1.2 細胞培養和染毒

SH-SY5Y 細胞使用DMEM 培養基, 在5% CO2和37?C 的恒溫恒濕條件下培養. 單層細胞達到80%以上時, 按1∶4～1∶3 的比例傳代培養.

在對數生長期, 用胰蛋白酶消化后, 離心, 重新懸浮, 接種于96 孔板(每孔3×103個細胞)、24 孔板(每孔1×104個細胞)、6 孔板(每孔5×104個細胞)以及35 mm 培養皿(每孔5×104個細胞), 分別供MTT 實驗、LDH 實驗、細胞凋亡分析和Ca2+濃度檢測實驗. 接種后隔夜令細胞貼壁生長, 棄培養基. 使用D-Hanks 清洗兩次, 加入含有OBC 顆粒的培養基進行染毒,1～48 h 后檢測. 根據24 和48 h 的細胞存活率,篩選OBC 顆粒染毒濃度分別為0, 5, 10, 20,40 μg/mL 的樣品. 每個濃度設置3～6 個平行樣, 實驗重復3 次.

1.3 MTT 實驗

染毒結束后棄去上清液, 使用D-Hanks 溶液清洗2 次, 每孔加入0.1 mL 用培養液稀釋10 倍的MTT 溶液, 37?C 繼續培養4 h. 棄上清液, 每孔加入100 μL DMSO, 室溫下振蕩10 min, 之后使用酶標儀檢測OD490值. 細胞存活率的計算公式如下:

（1）進口學習效應：進口中間產品內化了進口來源企業的研發努力與知識，同時經過進口的方式外溢到下游生產企業，減弱了企業研發新產品的成本；由于新產品里具備高層次水平的質量和技術成分，提升了企業對新產品的收益估值，再次刺激了企業研發行為。雖然無法全部替換掉差異化產品以及產品類型中內化的技術以及信息，但隨著進口中間產品多樣性的提高，進口學習效應也會逐漸增強。

式中, 實驗組為OBC 顆粒染毒組, 溶劑對照組為正常培養基培養細胞, 空白對照組為培養基組(未加入細胞).

1.4 LDH 活性檢測

染毒結束后, 吸取上層培養液至1.5 mL 的EP 管中, 離心5 min(1 200 r/min). 棄下層顆粒, 取100 μL 上清至EP 管中, 按照LDH 試劑盒的說明書依次加入相關試劑. 吸取最后一步所得溶液, 加至96 孔平底培養板中(每孔加200 μL). 用iMark-680 型酶聯免疫檢測儀測定吸光度(D), 波長為440 nm. 記錄數據, 并根據標準曲線計算所得LDH 濃度.

1.5 流式細胞術檢測

染毒結束后, 棄上層培養液, 用無EDTA 的胰蛋白酶消化, 重新懸浮細胞收集于1.5 mL 離心管中. 3 000 r/min 離心3 min, 棄上清. 使用預冷的PBS 重懸細胞, 3 000 r/min 離心3 min, 棄上清. 加入100 μL 的Binding Buffer 和2.5 μL 的Annexin V-FITC, 混勻后于室溫避光孵育15 min, 進行Annexin V-FITC 標記. 使用Binding Buffer 洗滌, 并重新懸浮細胞. 再加入100 μL 的Binding Buffer 和5 μL 的PI, 室溫避光孵育5 min, 進行PI 標記. 補加Binding Buffer 至500 μL, 在1 h 內用流式細胞儀檢測.

1.6 Ca2+濃度測定

染毒結束后, 棄上層培養液. 用D-Hanks 溶液洗滌細胞3 次, 加入已被D-Hanks 稀釋的Fluo 3-AM(終濃度為5μmol/L),37?C 孵育45 min. 棄去Fluo 3-AM 工作液,用D-Hanks 溶液洗滌3 次, 以充分去除殘留的Fluo 3-AM. 加入D-Hanks 溶液覆蓋細胞, 37?C 孵育20 min,以確保AM 在細胞內的完全去酯化, Fluo 3-AM 在細胞內轉變成Fluo 3. 使用熒光顯微鏡觀察細胞,激發波長為494 nm,發射波長為516 nm. 每個平行樣選取5～10 張照片,使用Ipwin32 圖像分析軟件分析熒光強度, 取其平均值. Ca2+水平用光密度值來表示, 并將所得結果與對照組做歸一化處理. 值得注意的是, 加入Fluo 3-AM 后所有操作都需要避光進行, 以免探針降解.

1.7 數據處理

數據以“算術平均值±標準差(X±SD)”的方式表示, 采用Microsoft Office Excel 2007 軟件進行分析和檢驗, 各指標組間差異采用t 檢驗法進行統計, 顯著性水平以*p ＜0.05,**p ＜0.01 為判斷標準.

2 結果與分析

2.1 細胞存活率

圖1 為OBC 顆粒染毒24 和48 h 后,SH-SY5Y 細胞的存活率.使用不同濃度(0～40μg/mL)的OBC 顆粒進行染毒后, SH-SY5Y 細胞的存活率有不同程度的下降, 并呈現出統計差異的劑量-效應關系(**p ＜0.01). OBC 顆粒染毒24 和48 h 后, 對SH-SY5Y 細胞的半致死濃度(LC50)分別為202.2 和133.3 μg/mL(通過線性回歸模型計算). 隨著染毒時間從24 h 增加到48 h, LC50值有所下降, 說明OBC 顆粒對SH-SY5Y 的細胞毒性隨著染毒時間的增加而增強.

圖1 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細胞存活率的影響Fig.1 Cell viability of SH-SY5Y cells after treated with different concerntrations of OBC particles

2.2 LDH 活性

圖2 為OBC 顆粒染毒24 h 后, SH-SY5Y 細胞培養液中LDH 的濃度水平. 可見, OBC 顆粒染毒24 h 后, 胞外LDH 的濃度顯著升高, 亦呈現劑量-效應關系(**p ＜0.01), 說明OBC 顆粒暴露導致明顯的SH-SY5Y 細胞損傷.

2.3 細胞凋亡

使用不同濃度(0, 5, 10, 20 和40 μg/mL)的OBC 顆粒. 染毒24 h 后, 經流式細胞儀分析, 細胞凋亡率如圖3 所示. 可見, OBC 顆粒可導致SH-SY5Y 細胞發生細胞凋亡, 且隨著染毒劑量的增加, 凋亡率不斷上升, 呈顯著的劑量-效應關系(**p ＜0.01). 在最高染毒劑量40 μg/mL 組, 細胞凋亡率達到7.0%(**p ＜0.01).

2.4 Ca2+濃度

圖4 為OBC 顆粒對SH-SY5Y 細胞內Ca2+水平的影響. 可見, 細胞內Ca2+濃度隨染毒時間的增加呈現先升高再降低的趨勢. 在染毒1～4 h 內, Ca2+濃度升高最顯著; 染毒6 h 后,Ca2+濃度逐漸回歸到正常水平. 染毒1 和4 h, 隨著OBC 劑量的升高, 呈現劑量-效應關系(**p ＜0.01).

圖2 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細胞LDH 水平的影響Fig.2 LDH release of SH-SY5Y cells after treated with different concerntrations of OBC particles

圖3 OBC 顆粒濃度對SH-SY5Y 細胞凋亡率的影響Fig.3 Apoptosis in SH-SY5Y cells induced by different concerntrations of OBC particles

圖4 OBC 染毒時間對SH-SY5Y 細胞內Ca2+水平的影響Fig.4 Ca2+ levels in SH-SY5Y cells induced by OBC exposure time

3 討 論

MTT 方法, 又稱為MTT 比色法, 可用于檢測細胞的增殖活性. 在體外培養細胞體系中,MTT 方法是評價外源物總體毒性的常規方法[18]. LDH 存在于機體所有組織細胞的胞質內,當細胞受到外源性刺激, 導致細胞膜損傷、細胞通透性增強后, LDH 可從細胞質中泄出至細胞外的培養基中. 通過檢測培養液中LDH 的濃度水平, 可以指示細胞受損傷的程度. 因此, 培養基中LDH 濃度亦可用于表征外源性物質的毒性大小[18]. 實驗結果表明: 經OBC 顆粒染毒24 和48 h 后, SH-SY5Y 細胞的增殖能力被顯著抑制, 呈現劑量和時間-效應關系; 染毒24 h 后,SH-SY5Y 細胞膜顯著受損, 亦呈現劑量-效應關系.

An等[15]研究了OBC 顆粒對人肺上皮細胞A549 的毒性作用. 結果發現, OBC 顆粒在染毒24 h 后, 可以導致細胞DNA 損傷和細胞死亡. Li等[17]的研究也發現, OBC 顆粒可以造成A549 細胞和16HBE 細胞顯著的毒性效應, 誘導細胞發生氧化應激, 造成細胞死亡. 以上研究中OBC 顆粒暴露24 h 導致細胞死亡的半致死濃度在100～200 μg/mL 之間, 與本研究結果基本一致.

檢測細胞凋亡的方法眾多. 本研究采用流式細胞術檢測凋亡, 可以對發生凋亡的細胞進行準確計數, 是一種常用的檢測方法. 研究結果顯示, OBC 顆粒可誘導SH-SY5Y 細胞發生細胞凋亡, 且隨著染毒劑量的增加, 凋亡率不斷上升. 在最高劑量40 μg/mL 時, 凋亡率達到7.0%, 顯著高于對照細胞, 具有統計學意義(**p ＜0.01). 有文獻報道, OBC 顆粒可誘導人肺上皮A549 細胞發生細胞凋亡和DNA 損傷[15], 與本研究結果一致.

Ca2+是機體內主要的細胞信使之一, 參與調控許多細胞的生理活動, 包括細胞分裂和細胞凋亡等. 有研究表明, Ca2+可能參與了大氣顆粒物誘導的細胞凋亡和炎癥反應. Brown等[19]發現, 大氣顆粒物既可增加細胞內Ca2+濃度又可促進活性氧的產生.Sakamoto等[20]發現, PM10可增加人支氣管上皮細胞內Ca2+濃度, 并且與炎癥因子IL-1β 和IL-8 的釋放有一定關聯. 本研究發現, BC 顆粒可導致神經細胞SH-SY5Y 中Ca2+濃度的增加, 染毒4 h, Ca2+濃度達到最高峰. 之后隨著染毒時間增加, Ca2+濃度逐漸趨于正常細胞. 動物和細胞實驗發現, BC 顆粒可以通過激活連接蛋白通道, 誘導谷氨酸鹽和ATP 的釋放, 進而活化小鼠大腦內星形膠質細胞, 誘發退行性神經系統疾病[13-14]. 本研究提示, 信號分子Ca2+可能在BC 顆粒誘導神經細胞凋亡及神經系統疾病的過程中起重要的調控作用, 值得進一步深入探討.

大氣顆粒物對神經系統的毒性作用, 已經在一些動物和細胞體系中得到證實. BC 顆粒是大氣顆粒物重要的組成部分. 本研究結果提示, OBC 顆粒可以誘導體外神經細胞Ca2+釋放,導致細胞凋亡, 進而在顆粒物導致神經系統疾病過程中起重要作用. 隨著經濟和工業的迅速發展, 化石燃料的消耗增長, 大氣中BC 顆粒的排放會不斷增加. 有調研資料表明, 一些城市地區的大氣中BC 顆粒的濃度處于較高水平[21]. 因此, 要更加關注城市大氣中BC 顆粒的濃度水平與其相應的健康影響.

4 結 論

(1) OBC 顆粒可顯著抑制SH-SY5Y 細胞的增殖, 造成細胞膜的損傷.

(2) OBC 顆粒可誘導SH-SY5Y 細胞發生凋亡, 呈現劑量-效應關系, 并能顯著增加細胞內Ca2+的濃度.

(3) OBC 顆粒體外暴露可導致神經細胞損傷, 胞內Ca2+濃度增加, 最后導致細胞凋亡.