1-氯-3-丁烯-2-醇的細胞遺傳毒性

李玉峰,劉欣杰,張新宇

(上海大學環境與化學工程學院環境污染與健康研究所, 上海200444)

1,3-丁二烯(簡稱丁二烯)是一種石油化工產品, 主要用于制造合成橡膠、樹脂和塑料. 它是一種無色氣體, 也是一種空氣污染物, 在環境中的主要來源是化石燃料和生物質的不完全燃燒, 如汽車尾氣和香煙煙霧等[1]. 因此, 丁二烯廣泛存在于城市空氣中, 其濃度范圍通常為(0.1 ～1.0)×10-9[1].

丁二烯是一種已確定的人類致癌物(IARC Group 1), 可在暴露人體上誘發淋巴-造血系統癌癥[1]. 丁二烯致癌風險很高，0.014×10-9濃度丁二烯的致癌風險水平達到了10-6[2], 而苯需要(0.04 ～0.14)×10-9濃度才能達到同樣的風險水平[3]. 已有多項研究表明, 丁二烯是具有最高致癌風險的環境污染物之一[4-7], 也是香煙煙霧中致癌性最強的化合物[8], 即使在二手煙和三手煙中也是最有害的揮發性有機化合物之一[9].

代謝是丁二烯致癌的根本原因. 丁二烯進入生物體內后可通過兩條途徑代謝, 產生多種具有致突變性的產物. 這兩條途徑分別稱為P450 途徑和MPO(myeloperoxidase, 髓過氧化酶)途徑(見圖1)[10]. 在P450 途徑中, 丁二烯在肝臟、腎臟和肺臟等器官中被P450 酶代謝為3,4-環氧-1-丁烯(3,4-epoxy-1-butene, EB)、1,2,3,4-雙環氧丁烷(1,2,3,4-diepoxybutane, DEB)和3,4-環氧-1,2-丁二醇(3,4-epoxy-1,2-butanediol, EBD)[1]. 在MPO 途徑中, 丁二烯在骨髓和血液白細胞中被MPO 代謝為1-氯-3-丁烯-2-醇(1-chloro-2-hydroxy-3-butene, CHB)[10-11]. 上述4 種產物已被證明具有致突變性. 由于丁二烯在人體內致癌作用的靶器官是淋巴-造血系統[1-2], 而骨髓是此系統的關鍵組成部分, 這提示MPO 途徑可能與丁二烯的致癌作用密切相關[10]. 因此, 作為這條途徑上的產物, CHB 可能在丁二烯致癌作用中起關鍵作用, 值得深入研究.

圖1 丁二烯的代謝途徑和主要代謝產物Fig.1 Metabolic pathways and major metabolites of 1,3-butadiene

由圖1 可知, CHB 可以在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)作用下進一步代謝為1-氯-3-丁烯-2-酮(1-chloro-3-buten-2-one, CBO)[12]. CBO 是一種強的Michael 受體,其分子兩端均可與親核試劑反應, 因此具有交聯能力. 研究發現: CBO 很容易與谷胱甘肽(glutathione,GSH)反應生成單/雙偶聯產物, 也容易與蛋白質反應并引起蛋白質交聯[12], 或者與核酸堿基及DNA 反應產生多種DNA 加合物[13-16]. CHB 和CBO 均有細胞毒性和遺傳毒性, 且CBO的毒性比CHB 強約100 倍, 但二者的遺傳毒性特征并不完全相同: CHB 會產生兩種類型的DNA 損傷, 即DNA 單鏈斷裂和堿性不穩定位點(alkali-labile sites, ALS), 但CBO 只產生ALS 損傷, 且CHB 還具有致突變性[17].

然而, 上述研究只是發現了CHB 具有遺傳毒性(即能夠引起DNA 損傷), 以及能夠引起兩種類型的DNA 損傷, 但CHB 引起DNA 損傷的途徑還不清楚. 有一種推測是CHB 的毒性可能是其在細胞內轉化為CBO 導致的, 因為CBO 毒性比CHB 強得多, 只要很少量CHB 被轉化為CBO 就足以引起顯著的毒性. 因此, 本工作對此進行了進一步研究, 發現CHB 毒性主要還是由其自身的反應性引起的, 而并非是由其在細胞內轉化為CBO 引起的.

1 實驗部分

1.1 試劑與材料

二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購于國藥集團化學試劑有限公司. 4-甲基吡唑(4-methylpyrazole,4-MP)和1-卞基咪唑(1-benzylimidazole,BI)購于Sigma-Aldrich. 3-丁烯-2-醇(3-buten-2-ol, BO)購于Alfa Aesar. DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)培養基、IMDM(Iscove’s modified Dulbecco’s medium)培養基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購于Life Technologies. 青霉素和鏈霉素購于北京鼎國生物科技有限公司. 人胚肝L02 細胞株和人白血病HL-60 細胞株購于中國科學院細胞庫. CHB 和CBO 按照文獻[12]方法合成.

1.2 細胞培養

L02 細胞在含10% FBS, 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養基中, 在含有5% CO2的37?C 培養箱中培養. 待細胞處于對數生長期, 生長至70%～80%時進行傳代或實驗. HL-60 細胞在含20% FBS, 100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的IMDM 培養基中, 在含有5% CO2的37?C 培養箱中培養. 待細胞處于對數生長期, 即細胞傳代后的24 h 之內進行實驗.

1.3 化合物遺傳毒性檢測的一般程序

除去細胞上的培養液(HL-60 細胞為懸浮細胞, 故需通過離心沉淀細胞后, 再除去上清液).待測化合物溶于DMSO 制成0.5 或1 mol/L 溶液, 以0.1%體積加入到無血清培養基中(當需要長時間(≥12 h)處理細胞時, 使用含有血清的培養基), 混合均勻后添加到細胞上. 在含有5% CO2的37?C培養箱中培養1 h 后, 用標準彗星實驗(the Comet assay)檢測DNA 損傷情況[18]. 陰性對照組細胞用含0.1%體積DMSO 的無血清培養基培養1 h.

彗星實驗, 又稱單細胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis, SCGE)分析, 是目前使用最廣泛的一種檢測真核細胞DNA 損傷的方法. 標準彗星實驗在強堿性(pH ＞13)條件下進行,可檢測DNA 的鏈斷裂、堿性不穩定位點(即失去堿基的位點)以及DNA-DNA/DNA-蛋白質交聯. 其基本原理是將細胞以單個狀態固定在瓊脂糖凝膠中, 經過裂解并去除組蛋白后, 只剩下裸露的DNA 留在瓊脂糖中, 再施以適當的直流電場進行電泳, 損傷的DNA 向陽極遷移而形成拖尾. 拖尾程度與DNA 損傷呈正相關關系, 因而可以以拖尾程度定量衡量DNA 受損程度. 由于電泳后觀察到的DNA 狀態(通過熒光染料染色)具有一個明亮的圓形頭部, 帶有一條較暗的尾部, 形似彗星, 故得名彗星實驗.

1.4 含有CHB 的培養基溶液放置不同時間后遺傳毒性的變化情況

按照1.3 節中的程序制備含有500 μmol/L CHB 的無血清培養基溶液, 在37?C 培養箱中分別放置0.5, 1, 4和18 h, 然后添加到L02 細胞上, 培養1 h, 用彗星實驗進行檢測.

1.5 CHB 引起的DNA 損傷隨著不同細胞處理時間的變化

按照1.3 節中的程序制備含有1 000 μmol/L CHB 的培養基溶液, 添加到L02 細胞上, 分別在培養箱中培養0.5, 1, 2, 4 和12 h, 用彗星實驗進行檢測.

1.6 P450 酶和ADH 抑制劑對CHB 遺傳毒性的影響

L02 和HL-60 細胞用含1 000 μmol/L BI 和1 000 μmol/L 4-MP 的無血清培養基培養1 h, 然后用1 000 μmol/L CHB 培養1 h, 用彗星實驗進行檢測.

1.7 數據處理方法

所有實驗設置至少3 個平行樣(平行樣具體數目見圖標中的說明), 取平行樣的平均值和標準偏差. 實驗組與對照組數據的比較使用Student’s t-test, 以0.05 作為統計顯著性的臨界值.

2 實驗結果

2.1 BO 的遺傳毒性

CHB 具有遺傳毒性. 從化學結構的角度分析, 這可能應歸因于CHB 分子中的氯甲基. 因為氯甲基的存在導致CHB 具有親電性, 可能與DNA 或蛋白質發生反應而產生毒性. 為驗證這一點, 本工作檢測了3-丁烯-2-醇(3-buten-2-ol, BO)的遺傳毒性. BO 與CHB 在結構上的唯一差別就是BO 分子中沒有氯原子.

結果表明, 500 和1 000 μmol/L BO 在細胞上沒有引起任何DNA 損傷, 而在同樣條件下,1 000 μmol/L CHB 產生的DNA 損傷達20.4% ± 3.0%(陰性對照組為7.4%±2.3%, 見圖2).因此可知, 氯甲基是CHB 遺傳毒性中的關鍵結構因素.

圖2 500 和1 000μmol/L BO 與1 000μmol/L CHB 引起的DNA 損傷對比(5 個平行樣,***p ＜0.001)Fig.2 DNA damage caused by 500, 1 000 μmol/L BO, and 1 000 μmol/L CHB (quintuplicate,***p ＜0.001)

2.2 含有CHB 的培養基溶液放置后遺傳毒性增強

CHB 分子中的氯甲基使得CHB 具有反應性, 不僅可能與生物分子發生反應, 而且還可能在溶液中發生水解等反應, 從而轉化為其他毒性化合物. 這也可能是CHB 具有遺傳毒性的原因之一. 為檢驗這種推測, 將含有500 μmol/L CHB 的無血清培養基在37?C 放置0.5, 1, 4 和18 h, 然后檢查培養基的毒性, 結果如圖3 所示.

含有CHB 的培養基溶液放置后毒性發生了改變. 與未放置的溶液(圖3 中0 h 的數據)相比, 放置0.5 和1 h 后的毒性實際上沒有發生變化(p ＞0.05). 然而, 放置4 和18 h 后的溶液毒性明顯增強, 且差異具有統計顯著性(*p ＜0.05, **p ＜0.01). 這說明CHB 在溶液中會轉化為其他毒性更強的化合物, 但此轉化過程較慢, 在1 h 內的轉化可忽略.

2.3 CHB 引起的DNA 損傷隨著細胞處理時間的變化

為觀察CHB 引起的DNA 損傷隨細胞處理時間的變化趨勢并與上述實驗結果進行對比,用1 000 μmol/L CHB 分別處理細胞0.5, 1, 2, 4 和12 h, 然后檢查DNA 損傷情況, 結果如圖4 所示.

圖3 含有500 μmol/L CHB 的無血清培養基溶液在37 ?C 放置不同時間后的遺傳毒性(3 個平行樣,*p ＜0.05, **p ＜0.01)Fig.3 Genotoxicity of 500 μmol/L CHB in FBS-free media after incubation at 37 ?C for specified time (triplicate, *p ＜0.05, **p ＜0.01)

圖4 1 000 μmol/L CHB 引起的DNA 損傷隨細胞處理時間不同的變化情況(4 個平行樣, **p ＜0.01,***p ＜0.001)Fig.4 DNA damage caused by 1 000 μmol/L CHB at different cell-incubation time (tetraplicate,**p ＜0.01, ***p ＜0.001)

結果表明, 在4 h 內, CHB 引起的DNA 損傷隨細胞處理時間的增加而增大. 與陰性對照組(4.6% ± 1.6%, 圖中未顯示)相比, 細胞用CHB 處理0.5 h 即產生了相當強的損傷(14.0%±3.7%, **p ＜0.01); 處理1 h 后損傷繼續增大, 但與0.5 h 的結果相比, 差異不具有統計顯著性. 然而, 處理2 和4 h 后產生的DNA 損傷與處理0.5 h 的相比, 差異具有統計顯著性(**p ＜0.01, ***p ＜0.001). 另一方面, 過長的處理時間(12 h)反而會導致DNA 損傷的減小(但此時的損傷仍然明顯高于0.5 h 的損傷, **p ＜0.01), 這可能是由于DNA 修復的緣故.

2.4 CHB 對DNA 的損傷機理

由于CHB 可被ADH 代謝為CBO, 而CBO 的毒性約為CHB 的100 倍, 因此只要1%的CHB 在細胞內被代謝為CBO, 就能產生觀察到的CHB 毒性結果. 為檢驗這種可能性, 使用ADH 抑制劑4-MP 進行實驗. 考慮到CHB 還可能被P450 酶代謝為CBO, 故也使用了P450廣譜抑制劑BI. 此實驗在L02 和HL-60 兩種細胞株上進行.

實驗結果顯示, 在兩種細胞株中, 加入抑制劑4-MP 和BI 后對于CHB 引起的DNA 損傷沒有影響(圖略), 表明CHB 的遺傳毒性不是通過轉化為CBO 產生的.

3 討 論

CHB 可能是1,3-丁二烯對人體產生致癌效應的一種關鍵代謝產物, 因此對它的研究非常重要. 已經發現CHB 能夠損傷DNA, 引起DNA 單鏈斷裂和ALS. 本工作的研究目的是希望闡明CHB 是通過什么途徑損傷DNA 的.

一種化合物可通過直接和間接途徑損傷DNA. 直接途徑就是化合物直接與DNA 發生反應, 形成DNA 加合物或引起DNA 脫堿基(即形成ALS)或DNA 斷裂. 間接途徑則較為復雜,包括: ①轉化為其他能直接與DNA 發生反應的化合物, 這種轉化可以是化學轉化(即通過簡單化學反應的轉化, 如水解等), 也可以是生物轉化(即在酶的作用下進行的轉化); ②其他細胞機理(主要是氧化應激).

沒有氯原子的對應化合物BO 即使在相當高的濃度(1 000 μmol/L)下都沒有表現出任何遺傳毒性, 而同樣條件下的CHB 則產生了強毒性(見圖2). 這說明氯甲基的存在是CHB 毒性產生的關鍵結構因素. 從化學反應性來看就容易解釋了. 因為氯甲基是親電性的, 且氯甲基相鄰碳原子上有一個羥基, 其吸電子能力進一步增強了氯甲基的親電性, 故氯甲基能與DNA 堿基中的氮原子發生親核取代反應, 從而損傷DNA. 因此, 就化學反應性而言, CHB 是能夠通過直接途徑損傷DNA 的.

含有CHB 的培養基溶液放置后出現了遺傳毒性增加的現象(見圖3), 表明CHB 能發生化學轉化, 且轉化形成的化合物毒性更強. 這可能也是氯甲基反應性引起的結果. 因為水分子中的氧原子或CHB 自身的羥基氧原子能與氯甲基發生親核取代反應, 即發生CHB 的水解或分子內的環合, 產生3-丁烯-1,2-二醇(3-buten-1,2-diol, BDD)或EB(見圖5). BDD 毒性很弱而EB 毒性較強[19], 故CHB 的化學轉化可能主要產生EB.

圖5 在溶液中CHB 可能轉化為EB 和BDDFig.5 CHB may be converted to EB and BDD in solution

然而, CHB 化學轉化過程較慢. 與未經放置的含有CHB 的培養基溶液相比, 放置0.5 和1 h 的溶液毒性實際上沒有變化(見圖3). 與此形成鮮明對照的是, 直接用CHB 溶液處理細胞時, 即使處理時間只有0.5 h, 產生的DNA 損傷已經相當強(見圖4). 顯然, 這說明CHB 的毒性是由其自身引起的, 而不是化學轉化為其他化合物的結果. 當然, 如果CHB 處理細胞的時間較長(≥4 h), 則不排除化學轉化對CHB 表現出來的毒性有一定貢獻的可能(見圖3 和4). 必須指出, 這種情況(即長時間處理細胞)較為復雜, 毒性可能產生累積效應, 故化學轉化對CHB毒性的貢獻只是一種推測, 證據尚不充分.

使用P450 酶和ADH 抑制劑的實驗結果表明, CHB 的毒性并非由于其生物轉化為CBO產生. 實際上, 已有文獻報道培養的肝細胞內沒有P450 和ADH 等代謝酶的表達[20]. 因此,CHB 在L02 細胞中引起DNA 損傷這一事實本身已經說明其毒性并非轉化為CBO 的結果.

最后, CHB 的毒性也不大可能是由其他細胞機理引起的. 本工作對CHB 是否引起氧化應激進行了初步檢測. 結果表明, CHB 在L02 細胞中沒有引起明顯的氧化應激.

綜上所述, 本研究結果說明, CHB 可能主要通過直接途徑(即直接與DNA 發生反應)而不是通過轉化為CBO 損傷DNA. 但在長時間(≥4 h)處理細胞的情況下, 化學轉化為其他毒性化合物可能對CHB 的毒性產生也有一定貢獻.

4 結束語

本工作對CHB 產生遺傳毒性的原因進行了研究, 發現CHB 主要通過直接途經引起DNA損傷. 這可能歸因于CHB 的親電反應性. 研究結果對于深入理解CHB 的毒性和致突變性提供了重要的基礎.