大黃素抑制胰腺癌新生血管形成的機制研究

陳敏遠 鄭晨果 劉長寶 王兆洪

大黃素是一種蔥醒類物質，能抑制多種惡性腫瘤細胞生長并誘導凋亡[1-3]。最近研究發現，大黃素也能通過抑制腫瘤新生血管形成，從而抑制腫瘤生長[4]。本實驗在裸鼠原位移植瘤模型基礎上研究大黃素抑制胰腺癌新生血管生成的機制，并探討微小RNA（microRNA）在大黃素抑制胰腺癌新生血管形成中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑 大黃素（純度＞98%，美國Sigma公司，批號E7881），用二甲基亞砜（DMSO）溶解，DMSO 的終濃度＜0.1%；內皮細胞標記物CD31、CD34，血管內皮生長因子（VEGF）單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司，批號CD1-H5224、CD4-H5255、Santa023）；Trizol （美 國Invitrogen 公 司， 批 號12183555）；Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit 和Takara SYBR Premix Ex Taq TM II（日本Takara 公司，批號D350A、DRR041A）；熒光定量PCR（qRT-PCR）反應所需引物由上海基康生物有限公司合成。

1.2 細胞系和動物 人胰腺癌細胞株SW1990（美國組織培養庫ATCC）；雌性BALB/c 裸鼠（中國科學院上海動物實驗中心）40 只，4～6 周齡，體質量20～22g，實驗動物使用許可證號：SYXK（浙）2015-0009。飼養于無特定病原體動物級（SPF 級）屏障系統的潔凈層流架內，室溫控制在（25±1）℃，相對濕度40%～60%。本實驗經溫州醫科大學實驗動物中心動物實驗倫理審核通過（批準編號：wydw2019-0012）。

1.3 動物模型制備 （1）皮下移植瘤制備：取對數生長期的SW1990 細胞約2×106注射于裸鼠皮下，1 個月后生長成約1cm3皮下移植瘤，無菌條件下處死裸鼠取出腫瘤組織，選取健康腫瘤組織剪成1mm3的組織塊待用。（2）胰腺癌裸鼠原位移植瘤制備：50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉裸鼠，取左上腹腹直肌旁切口，暴露胰尾并打開胰腺被膜，將瘤塊置入胰尾后縫合被膜。

1.4 分組和給藥 將40 只BALB/c 裸鼠用隨機數字表法分為對照組和大黃素低、中、高劑量組（20、40、80mg/kg）[5]，每組10 只。手術后第3 周開始給藥，對照組給予DMSO 終濃度＜0.1%的生理鹽水，腹腔注射；大黃素低劑量組給予20mg/kg 大黃素，腹腔注射；大黃素中劑量組給予40mg/kg 大黃素，腹腔注射；大黃素高劑量組給予80mg/kg 大黃素，腹腔注射；各組均每周治療3 次，共治療2 周[5]。末次用藥1 周后予用戊巴比妥麻醉裸鼠，取部分腫瘤組織4%多聚甲醛固定，待免疫組織化學染色；另一部分腫瘤組織存于液氮中，待Western blot 和qRT-PCR 檢測。

1.5 免疫組化法檢測各組原位移植瘤微血管密度（MVD） 取固定好的腫瘤組織，經脫蠟、水化、3%H2O2封閉以及高壓熱抗原修復后，加入兔血清封閉，CD31/CD34 一抗體4℃孵育過夜，PBS 洗滌后滴加辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗室溫孵育30min，DAB 顯色3～5min，蘇木素復染后樹脂封片鏡檢。低倍鏡（100×）下尋取血管熱點區域，然后高倍鏡（400×） 下隨機選擇5 個視野，計數每個視野中CD31/CD34 陽性細胞數，其平均值即為微血管密度[6]。

1.6 Western blot 法檢測各組原位移植瘤VEGF 蛋白表達 取新鮮腫瘤組織，RIPA 裂解液裂解組織，提取上清，BCA 方法定量蛋白濃度。12%SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳，半干轉膜法轉膜，含5%無脂牛奶TBST 封閉，滴加VEGF 一抗4℃孵育過夜，HRP 標記的二抗孵育2h，用ECL 發光液顯色。GAPDH 為內參。

1.7 qRT-PCR 法測定各組miR-20b，miR-21，miR-155，miR-210 表達 按照Trizol 試劑盒使用說明書從腫瘤組織提取總RNA，并計算RNA 純度和濃度。選取OD260/OD280 比值在1.8～2.0 之間的RNA 進行后續試驗。依據Takara One Step PrimeScript microRNA cDNA Synthesis Kit（Perfect Real Time）試劑盒說明書配制反應液，將microRNA 逆轉錄（即RT 反應）為cDNA。依據Takara SYBR Premix Ex Taq TM II（Perfect Real Time）試劑盒說明書配置反應液，加入miR 引物序列與Uni-miR qPCR Primer，將PCR 反應管離心機輕輕離心后放入LightCycler 480 Real Time PCR 擴增儀中進行Real Time PCR反應。Uni-miR qPCR Primer 為寶生物公司通用引物。內參U6 引物由寶生物公司提供。其余反應所需引物由寶生物公司與上海基康生物有限公司合成。用于qRT-PCR 的引物序列如下：miR-20b 5′ -CAAA GUGCUCAUAGUGCAGGUAG-3′；miR-21 5′-UAGC UUAUCAGACUGAUGUUGA-3′；miR-155 5′-UUAA UGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′；miR-210 5′-AGC UACAUUGUCUGCUGGGUUUC-3′。

1.8 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組化檢測MVD 與對照組比較，大黃素低、中、高劑量組MVD 均降低（P 均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組MVD 明顯降低（P 均＜0.05）；中、高劑量組間MVD 比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

2.2 Western blot 檢測VEGF 表達 與對照組比較，大黃素低、中、高劑量組VEGF 蛋白表達量均下調（P均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組VEGF 蛋白表達量明顯下調（P 均＜0.05），且高劑量組較中劑量組下調更明顯（P＜0.05），見圖1，表2。

表1 按CD31/CD34 計算微血管密度

表1 按CD31/CD34 計算微血管密度

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；MVD：微血管密度；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；CD：白細胞分化抗原

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數10 10 10 10按CD31 計算19.3±1.9 11.7±1.6*7.9±2.3*△7.2±1.8*△按CD34 計算16.5±1.1 12.3±1.8*5.4±1.6*△4.8±1.6*△

圖1 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響

表2 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響（差異倍數）

表2 大黃素對VEGF 蛋白表達的影響（差異倍數）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，▲P＜0.05；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；VEGF：血管內皮生長因子

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數10 10 10 10 VEGF 1.000±0.054 0.533±0.039*0.381±0.032*△0.278±0.031*△▲

2.3 qRT-PCR 法檢測microRNA 表達 與對照組比較，大黃素組低、中、高劑量miR-20b、miR-21、miR-155 及miR-210 表達水平均降低（P 均＜0.05）；與低劑量組比較，中、高劑量組miR-20b、miR-21、miR-210 及高劑量組miR-155 表達水平降低（P 均＜0.05），且高劑量組miR-20b、miR-21、miR-155 及miR-210 表達較中劑量組降低更明顯（P 均＜0.05），見表3。

3 討 論

新生血管的生成對于腫瘤的生長是不可或缺的[6]。腫瘤依靠來自病灶周圍原有的血管提供的營養物質生長，隨著腫瘤體積慢慢變大至約1～2mm3時，原有的血管提供的營養物質相對不足，刺激腫瘤細胞分泌各種促進新生血管產生的細胞因子。而腫瘤內部新血管網絡的形成，突破了腫瘤繼續生長的瓶頸。研究表明，大黃素在體內外可抑制惡性腫瘤的生長、轉移，但大黃素對腫瘤新生血管的研究卻鮮有報道[1-3]。腫瘤的血管密度可以作為預測患者病情發展的指標，與腫瘤通過血管的遠處轉移亦密切相關；免疫組化顯示的MVD 和腫瘤侵襲轉移的潛力正相關[7]。本研究結果顯示，大黃素各劑量組MVD 較對照組明顯降低（P＜0.05）。這一結果與之前的文獻報道相一致，因此我們推斷，大黃素可能通過抑制腫瘤血管新生而抑制腫瘤的生長、發展[4]。

表3 大黃素對microRNA 表達的影響（差異倍數）

表3 大黃素對microRNA 表達的影響（差異倍數）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05；與中劑量組比較，▲P＜0.05；對照組：生理鹽水腹腔注射；低劑量組：20mg/kg 大黃素腹腔注射；中劑量組：40mg/kg 大黃素腹腔注射；高劑量組：80mg/kg 大黃素腹腔注射；micro RNA：微小RNA

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組大黃素劑量（mg/kg）0 20 40 80鼠數10 10 10 10 miR-20b 1.000±0.083 1.398±0.128*1.588±0.140*△2.336±0.354*△▲miR-21 1.000±0.212 0.449±0.126*0.240±0.051*△0.147±0.029*△▲miR-155 1.000±0.076 0.581±0.128*0.523±0.071*0.402±0.058*△▲miR-210 1.000±0.104 0.378±0.055*0.239±0.034*△0.185±0.043*△▲

VEGF 是主要的促新生血管因子，它使毛細血管的通透性改變，以纖維蛋白原為主的血漿蛋白到達血管外，為形成新的毛細血管結構提供土壤，而這些毛細血管網最終能為腫瘤細胞的生長帶來豐富的養分；VEGF 的另一個功能是與細胞表面的血管內皮生長因子受體結合，通過后續的細胞信號轉導，刺激血管內皮細胞分裂增加，數量增多，從而促進血管的新生[8]。本研究結果顯示，VEGF 在對照組中高表達，在大黃素組均低表達，且與大黃素濃度相關。這說明大黃素可能通過抑制VEGF 的表達，使VEGF 與其受體的結合減少，從而降低其促血管生成的作用。

有研究表明，miR-21 使VEGF 和激活蛋白1（AP1）mRNA 和蛋白的表達增加[9]。miR-21 還可通過負性調節RECK 和TIMP3 等金屬蛋白酶（MMPs）抑制劑，導致金屬蛋白酶活化后致使腫瘤侵襲能力增強。Park 等[10]發現抑制miR-21 或miR-221 的表達與耐藥有關。在含氧量正常的細胞中，抑制miR-20b 導致缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和VEGF 的表達增多，而在缺氧的腫瘤細胞中，miR-20b 增多則使HIF-1α和VEGF 的表達減少[11]。miR-155、miR-210 作為癌基因存在于胰腺癌，具有抗腫瘤凋亡和促進腫瘤細胞的血管新生等作用[12]。miR-210 被證明在腫瘤細胞中與VEGF 同步過表達，并上調血管內皮生長因子受體2（VEGF-R2）和ephrinA3，從而顯著促進缺血區毛細血管新生。而miR-155 也被報道與Smad 有重要關系[13]。本研究發現，大黃素可促進miR-20b 的表達，顯著抑制miR-21、miR-155、miR-210 的表達，且與大黃素濃度呈相關性。大黃素可能通過抑制相關的microRNA 而抑制腫瘤新生血管的形成，進而抑制胰腺癌原位移植瘤的生長。