培元化瘀方對家兔慢性硬膜下血腫模型的干預作用及其作用機制研究

范小璇，梁格婷，趙曉平，王凱，李隴平，段海峰，方永軍，侯文

慢性硬膜下血腫（chronic subdural hematoma，CSDH）是神經外科常見疾病之一，好發于老年人，其約占所有顱內血腫的10%，硬膜下血腫的25%［1］。目前，外科手術是臨床治療CSDH的首選，但CSDH患者術后復發風險較高，且部分臨床癥狀不明顯的患者不愿接受手術治療，因此如何提高CSDH藥物治療效果成為臨床亟待解決的問題之一。中醫學理論認為，CSDH的主要病機是髓海空虛、瘀阻腦絡，治當補腎益精填髓、化瘀通絡，筆者根據其病機、治則采用經驗方培元化瘀方治療CSDH取得良好療效，但其作用機制尚未明確。本實驗于2018年3—9月完成，旨在探討培元化瘀方對家兔CSDH模型的干預作用及其作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康新西蘭家兔30只，由第四軍醫大學實驗動物中心提供（動物合格證號：SCXK-軍2012-0007），雌雄不限；月齡7～10個月，平均月齡（8.2±1.4）個月；體質量2.0～3.0g，平均體質量（2.5±0.5）kg。

1.2 造模方法 造模方法參照文獻［2］，具體如下：3%戊巴比妥（30 mg/kg）經耳緣靜脈注射，麻醉成功后常規消毒、鋪巾；以矢狀縫右側5 mm、冠狀縫后方5 mm為中心，采用牙科鉆磨開顱骨并形成3 mm×3 mm骨窗，充分暴露硬腦膜，確認無明顯出血后采用尖刀在骨窗中央切開一小孔，將麻醉用硬膜外導管一端沿硬腦膜下腔平向顳部置入骨窗邊緣約5 mm，置入過程中如遇阻力可略退并調整導管方向；經導管向顱內注水、沖洗，確認顱內無出血（注水無明顯阻力、骨窗流出液體清亮）后采用小塊明膠海綿填塞及骨蠟填塞、密封，縫合頭皮后采用紅霉素軟膏涂抹創口；將麻醉用硬膜外導管另一端連接導管連接器并封管，并將導管固定在兩耳根中間以防止導管脫落；分別于造模后第 3、6、9、12、15 天重復注血，造模后21天經顱腦CT掃描證實CSDH形成的家兔納入實驗。

1.3 分組及干預方法 造模過程中4只家兔死亡（其中1只死于麻醉過量，3只死于造模后注血階段），顱腦CT掃描結果顯示CSDH未形成的家兔5只，最終造模成功21只，造模成功率為80.8%。采用隨機數字表法將造模成功的21只家兔分為模型組、低劑量組、高劑量組，每組7只。模型組家兔給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，15 ml/次，2次/d；低劑量組家兔給予培元化瘀方3.1 g/kg+0.9%氯化鈉溶液稀釋至15 ml后灌胃，2次/d；高劑量組家兔給予培元化瘀方6.2 g/kg+0.9%氯化鈉溶液稀釋至15 ml后灌胃，2次/d。三組家兔均連續灌胃7 d。

1.4 培元化瘀方的制備 培元化瘀方由黃芪30 g、當歸15 g、（生）地黃12 g、（熟）地黃12 g、黨參6 g、紅花12 g、桃仁6 g、地龍6 g、黃精12 g、鹿角膠6 g、甘草6 g組成，統一由陜西中醫藥大學附屬醫院制劑中心煎制成1 g/ml溶液備用；根據“人和動物的體表面積計算法、不同種類動物之間藥物劑量換算法”計算家兔培元化瘀方劑量，以人培元化瘀方劑量直接換算所得劑量為低劑量，2倍劑量為高劑量。

1.5 觀察指標

1.5.1 Purty評分 采用Purty評分評估三組家兔灌胃前及灌胃后第1、3、5、7天神經功能缺損程度，該評分包括意識（計1～4分）、行為（計1～4分）、轉頭（計0～1分）、盤旋（計0～1分）及偏盲（計0～1分）5項，總分2～11分，其中2分表示無神經功能缺損，11分表示意識喪失或死亡，評分越高表明神經功能缺損程度越重［3］。

1.5.2 殘余血腫量 三組家兔于最后1次灌胃次日采用3%戊巴比妥（30 mg/kg）經耳緣靜脈注射，麻醉成功后切開頭皮、暴露右側顱骨，采用持針器咬除部分骨瓣并注意保持硬膜完整，采用微量進樣器吸取硬膜下殘余液體，即為殘余血腫量。

1.5.3 病理學特征 剝離三組家兔血腫外膜及血腫同側腦組織，常規甲醛固定、石蠟包埋及組織切片，采用HE染色法觀察血腫外膜及血腫同側腦組織形態學變化，并采用免疫組化染色法及IPP法分析血腫外膜血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相對表達量；上述染色、鏡下觀察及VEGF的測定等均于西安交通大學醫學部病理實驗室完成。

1.6 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，符合正態分布的資料以（±s）表示，重復測量數據采用雙因素重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Purty評分 時間與方法在Purty評分上存在交互作用（P＜0.05）；時間在Purty評分上主效應顯著（P＜0.05）；方法在Purty評分上主效應顯著（P＜0.05）。灌胃后第7天低劑量組、高劑量組家兔Purty評分低于灌胃前，差異有統計學意義（P＜0.05）；灌胃后第7天高劑量組家兔Purty評分低于模型組、低劑量組，低劑量組家兔Purty評分低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 三組家兔灌胃前及灌胃后不同時間點Purty評分比較（±s，分）Table 1 Comparison of Purty score in three groups of rabbits before intragastric administration and at different time points after intragastric administration

表1 三組家兔灌胃前及灌胃后不同時間點Purty評分比較（±s，分）Table 1 Comparison of Purty score in three groups of rabbits before intragastric administration and at different time points after intragastric administration

注：與灌胃前比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05

組別 只數 灌胃前 灌胃后第1天 灌胃后第3天 灌胃后第5天 灌胃后第7天模型組 7 6.00±0.40 5.86±0.37 5.79±0.52 5.57±0.40 5.64±0.27低劑量組 7 6.15±0.64 5.82±0.28 5.30±0.58 4.71±0.34 3.88±0.23ab高劑量組 7 6.18±0.52 5.64±0.44 5.02±0.28 4.13±0.20 3.02±0.69abc F值 F時間=2.799，F組間=3.375，F交互=1.844 P值 P時間=0.030，P組間=0.038，P交互=0.041

2.2 殘余血腫量 高劑量組有1只家兔血腫完全吸收而未成功吸取出硬膜下殘余液體。模型組、低劑量組、高劑量組家兔殘余血腫量分別為（56.95±4.83）、（39.57±4.04）、（29.89±5.22）μl， 差 異 有 統 計 學 意 義（F=25.292，P＜0.05）；高劑量組家兔殘余血腫量少于低劑量組、模型組，低劑量組家兔殘余血腫量少于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 三組家兔血腫外膜病理學特征（HE染色，×400）Figure 1 Pathological features of hematoma adventitia in three groups of rabbits

2.3 病理學特征 （1）三組家兔血腫外膜均出現大量新生毛細血管、成纖維細胞、炎性細胞，且成纖維細胞活化明顯，而與模型組相比，低劑量組、高劑量組家兔纖維組織趨于成熟、炎性反應較輕（見圖1）。（2）模型組家兔血腫同側腦組織內存活神經元數量少于低劑量組、高劑量組，而低劑量組與高劑量組家兔血腫同側腦組織內存活神經元數量接近（見圖2）。（3）三組家兔血腫外膜內皮細胞、纖維組織及漿細胞表面均見VEGF陽性表達（見圖3）。模型組、低劑量組、高劑量組家兔血腫外膜VEGF相對表達量分別為（0.132±0.011）、（0.102±0.009）、（0.097±0.010），差異有統計學意義（F=15.887，P＜0.05）；模型組家兔血腫外膜VEGF相對表達量高于低劑量組、高劑量組，差異有統計學意義（P＜0.05），而低劑量組與高劑量組家兔血腫外膜VEGF相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 三組家兔血腫同側腦組織病理學特征（HE染色，×400）Figure 2 Pathological features of ipsilateral brain tissue of hematoma in three groups of rabbits

圖3 三組家兔血腫外膜VEGF表達情況（免疫組化染色，×400）Figure 3 Expression of VEGF in hematoma adventitia in the three groups of rabbits

3 討論

目前，CSDH的治療仍以鉆孔引流術為主，但由于CSDH病變位置特殊且在老年人群高發，因此即使經及時、正規手術治療，但整體治療效果并不十分理想，術后復發率介于2.3%～33.0%［4］。近年來，“CSDH是一種炎性血管生成性疾病”的觀點得到越來越多的認可，且研究證實CSDH復發患者VEGF水平及血腫外膜VEGF表達量與非復發患者相比明顯升高［5-6］。研究表明，CSDH外膜質地較厚并含有豐富的纖維蛋白溶酶原及大量新生毛細血管，但這種新生毛細血管內皮細胞層薄弱、基膜不成熟、可反復出血與生成，進而刺激硬腦膜邊緣細胞不斷增生并促使新膜持續形成，最終形成惡性循環［7］，而VEGF作為最強的促血管生成調控因子在CSDH患者血腫腔及外膜呈高表達亦證實了這一機制［8］。OSUKA 等［9］研究發現，VEGF可激活血腫外膜上有絲分裂原活化蛋白激酶信號通路，繼而促進外膜血管生成，因此抑制血腫、血腫外膜血管再生及VEGF的表達是控制CSDH復發的有效途徑。此外，CSDH在老年人群高發且多集中于66～74歲［10］，＞60歲老年人CSDH復發風險明顯升高［11］，而腦萎縮所致出血是導致老年人CSDH發生及復發的重要原因［12］，因此老年人腦萎縮這一特點值得關注，且是治療CSDH的關鍵問題之一。

中醫學理論認為，CSDH屬“頭痛”范疇，而頭部創傷是CSDH的主要誘因［13］。頭部創傷，傷及腦絡，絡傷血溢，瘀血內停，阻滯腦絡，而“腎生髓，腦為髓海”，腦為元神之府，腎中精氣足則髓盈，上注于腦，可統帥調節全身精神活動。老年人由于腎中精氣漸衰，無以灌注而致腦髓空虛、神無所歸，頭傷日久，耗氣傷精，氣機失調致氣血運行失常，瘀阻于絡，腦失所養，故頭暈頭痛，氣機逆亂，元氣虧虛，無源化生行血，不能布達四肢，氣血瘀滯，血脈痹阻則肢體萎軟偏廢。國醫大師任繼學教授認為，髓由腎精所化，脊髓上行于腦，泌其津液潤養腦髓［14］，因此CSDH的主要病機是腎精虧虛、瘀阻腦絡，為本虛標實之證，病位在腦且與腎密切相關，治當以補腎益髓，化瘀通絡為法。筆者根據上述理論擬定培元化瘀方，方中黃芪益氣補三焦，（熟）地黃補腎益髓，當歸補血活血，三者共為君藥，益氣補腎活血；桃仁、紅花破血祛瘀，黃精補精益髓，鹿角膠溫補肝腎、益精養血，共為臣藥，助（熟）地黃補腎，助黨歸化瘀；佐藥黨參益氣行氣，地龍通絡祛瘀，（生）地黃佐制補腎之品燥熱；甘草為使，調和諸藥，共同發揮培元生精益髓、行氣化瘀通絡之功效。

本研究結果顯示，灌胃后第7天高劑量組家兔Purty評分低于模型組、低劑量組，低劑量組家兔Purty評分低于模型組，表明培元化瘀方可有效減輕CSDH家兔神經功能缺損程度且呈劑量依賴性；高劑量組家兔殘余血腫量少于低劑量組、模型組，低劑量組家兔殘余血腫量少于模型組，表明培元化瘀方可有效促進CSDH家兔血腫吸收。本研究進一步通過鏡下觀察發現，與模型組相比，低劑量組、高劑量組家兔纖維組織趨于成熟、炎性反應較輕且血腫外膜VEGF相對表達量較低，與既往研究結果一致［5-6］，從病理生理機制方面證實培元化瘀方能促進CSDH家兔血腫吸收，而降低血腫外膜VEGF表達、減少病理性血管形成（如減慢血腫外膜新生脆弱血管生成速度、減緩新生血管反復再出血）可能是培元化瘀方治療CSDH的重要機制；但本研究未發現低劑量組與高劑量組家兔血腫外膜VEGF相對表達量存在差異，因此培元化瘀方通過抑制VEGF表達而治療CSDH是否存在劑量依賴性仍需進一步深入研究。

需要指出的是，中醫學所指“腦髓”的現代生物學基礎是腦內神經元和神經營養因子，腦內神經營養因子減少、神經元大量萎縮或丟失則造成“髓海不足”［12，15］，且已有研究證實“補腎”與“益腦髓”之間存有明顯的生物學關系［16］。由于神經元凋亡及神經干細胞增殖、分化與腎精盛衰有關，而補腎中藥能促進神經干細胞更新，因此補腎填精法可作為治療中樞神經系統病變的重要原則。本研究結果顯示，與模型組相比，低劑量組、高劑量組家兔血腫同側腦組織內存活神經元數量較多，提示培元化瘀方可抑制CSDH家兔受壓腦組織神經元壞死、凋亡，而這可能也是培元固本、益精填髓中藥治療CSDH的另一優勢。

綜上所述，培元化瘀方可有效減輕CSDH家兔神經功能缺損程度并促進血腫吸收，其作用機制可能與抑制血腫及血腫外膜炎性反應、VEGF的表達、受壓腦組織神經元壞死及凋亡等有關；但本研究為家兔實驗且樣本量較小、關注點集中于血腫外膜血管新生方面，培元化瘀方對促進血腫外膜血管新生炎癥的干預作用及中藥組方多靶點干預機制等仍需進一步深入研究。