KAI1基因在肝癌中的表達及與HBV關系的研究

余國政 柯立池 張麗君 周靜 胡如進 夏林 楊璐

[1.鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)普外科；2.鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)腫瘤科，湖北 黃石 435000；3.咸寧市中心醫院(湖北科技學院附屬醫院)手術室，湖北 咸寧 437000]

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球常見惡性腫瘤之一，全球每年的肝癌新發病例數為74.8萬，死亡例數為69.6萬[1-2]，在所有癌癥導致的死亡中肝癌居第3位[3-4]，且發病率和死亡率在世界范圍內不斷上升[5-6]。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是引發肝纖維化和肝細胞癌的首要原因[7]。中國是世界肝癌第一大國，肝癌的發生與HBV 感染關系密切。KAI1基因是新發現的一種腫瘤轉移抑制基因，其表達缺失與人類許多上皮細胞惡化、侵襲、轉移有關[8-9]，而在肝癌組織中的表達水平與HBV的關系尚未見報道，HBV是否通過影響KAI1的表達來調控肝癌發生與進展尚缺乏研究資料。本實驗通過檢測肝癌組織中KAI1的表達差異，及體外實驗檢測HBV與KAI1的相關性來初步探討HBV 感染與KAI1表達在肝癌發生、發展中的關系。

1 材料與方法

1.1材料 收集黃石市中心醫院普外科及腫瘤科2015年1月1日至2017年12月31日肝癌患者術后新鮮組織標本癌及對應癌旁組織27對。所有標本均經過病理學確診為肝癌，臨床資料完整，且27例肝癌患者均為HBV陽性感染者。

1.2細胞、質粒與主要試劑 HepG2細胞為本實驗室保存，重組質粒pCMV-HBV 1.3倍體、啟動子pGL3-KAI1及相應對照pCMV-pblue、pGL3-flag-2b為本實驗室構建。其中啟動子pGL3-KAI1長度為轉錄啟始位點上游1870bp，經證實為KAI1全長啟動子。DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司，相關試劑盒購自Qiagen公司，Lipo2000、定熒光素酶活性所需的試劑及抗體和酶均購自Sigam公司，引物由擎科合成。

1.3方法

1.3.1癌及癌旁組織中KAI1的mRNA和蛋白水平檢測 將27對組織分別勻槳，分成兩部分，一部分用RIPA裂解液提取總蛋白，Bradford法檢測其濃度，取100 μg總蛋白進行電泳，10% SDS-PAGE中電泳完畢后將凝膠中的蛋白轉移至硝酸纖維素膜上，5%的牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗人多克隆抗體，1∶ 2 000)，4 ℃過夜；洗膜，再加入二抗(羊抗兔IgG-HRP，1∶5000)孵育1 h，洗膜后進行ECL顯色。利用相關圖像分析軟件掃描分析條帶的灰度值。另一部分用Trizol法提取總RNA并逆轉錄成cDNA，然后進行real-time PCR。引物：Kai1上游引物5c-AGGATGCCTGGGACTACGTG-3c，下游引物5c-GCTCAGCGTTGTCTGTCCAGT-3c；GAPDH上游引物5c-TCGTGCGTGACATTAGGAG-3c，下游引物5c-GTCAGGCAGCTCGTAGCTCT-3c。擴增條件：94 ℃變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，40 個循環。實驗重復三次。

1.3.2熒光素酶報告基因實驗 培養細胞，將對數生長期的HepG2細胞消化計數，均勻鋪到24孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養，使轉染時細胞密度達到70%左右，根據Lipo2000說明書要求共同瞬時轉染pCMV-HBV 1.3倍體+啟動子pGL3-KAI1及對照pCMV-pblue+pGL3-flag-2b，各設三個復孔。送入培養箱中培養48 h后收樣，裂解。測定luciferase活性。實驗重復三次。

1.3.3測定KAI1啟動子甲基化實驗 將對數生長期的HepG2細胞消化計數，均勻鋪到6孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養，使轉染時細胞達到70%左右，根據Lipo2000說明書要求瞬時轉染pCMV-HBV 1.3及對照pCMV-pblue，送入培養箱中培養48 h后收樣，提取基因組。送博淼生物科技(北京)有限公司檢測KAI1啟動甲基化情況。另將KAI1啟動子報告質粒與HBV 1.3倍體共轉，6 h后，分別在培養基中加入終濃度為1 μM 、2 μM、4 μM的甲基化抑制劑5-aza_CdR。37 ℃，5% CO2孵箱培養48 h，分別用熒光素酶活性檢測、real-time PCR 和Western blot檢測。實驗重復三次。

1.3.4體外實驗檢測HBV與KAI1的關系 將對數生長期的HepG2細胞消化計數，均勻鋪到6孔板中，37 ℃，5% CO2孵箱培養，使轉染時細胞達到70%左右，根據Lipo2000說明書要求瞬時轉染pCMV-HBV 1.3倍體及對照pCMV-pblue，送入培養箱中培養48 h后收樣。分成兩部分，一部分用于檢測蛋白水平，另一部分用于檢測mRNA水平，方法及試劑同1.3.1。實驗重復三次。

1.4統計學方法 運用統計軟件SPSS17.0對數據進行統計學分析。采用卡方檢驗，檢驗水準按α=0.05，Ρ<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

27對癌及癌旁組織除三對未檢測出KAI1表達外，其余24對中癌組織的mRNA水平和蛋白水平均明顯低于癌旁組織的表達(P<0.05)。見圖1。

圖1 KAI1在肝癌和癌旁組織中的表達

熒光素酶報告基因實驗中測得luciferase活性值，pCMV-HBV 1.3倍體明顯低于對照組(P<0.01)。見圖2。

圖2 HBV對KAI1啟動子的影響

將HepG2+HBV及對照HepG2+Pblue的基因組送檢測發現HepG2+HBV基因組的KAI1啟動子區發生了甲基化，且加入甲基化抑制劑5-aza_CdR后，KAI1啟動子的mRNA和蛋白質水平隨著甲基化抑制劑濃度的增加而升高。見圖3。

圖3 實驗組HepG2+HBV和對照組HepG2+Pblue中KAI1啟動子的整體甲基化水平

體外實驗結果顯示，轉染了HBV的實驗組中的KAI1的mRNA表達及蛋白表達明顯低于對照組(P<0.05)。提示HBV可以影響KAI1的表達水平，可能是通過HBV對KAI1啟動子甲基化實現的。見圖4。

圖4 體外實驗KAI1的mRNA表達

3 討 論

KAI1 基因是1995 年Dong 等[10]發現的一種新的腫瘤轉移抑制基因，首先發現于前列腺癌細胞中，后經研究證實，在多種腫瘤中均伴有KAI1的表達下降或缺失。目前認為KAI1對絕大多數腫瘤的轉移起抑制作用，與腫瘤的侵襲力、預后明顯相關[11-13]。KAI1表達下調或缺失可能是導致肝癌的重要因素之一，但其具體機制尚待研究。

DNA 甲基化是真核生物遺傳物質化學修飾的一種方式，甲基化是由DNA 甲基化轉移酶(DNMT)催化完成的，在正常細胞中某些基因的重復序列處于高甲基化水平，這樣可以防止被轉錄因子的重新活化從而維持基因組的穩定[14-16]。如果體細胞的正常甲基化發生改變(基因組整體低甲基化)，將導致細胞生長失控；特異位點甲基化程度改變(抑癌基因啟動子區CpG 島的過甲基化)則可導致腫瘤的發生。本課題中KAI1 及HBV的影響明顯發生了甲基化，這種變化是腫瘤細胞的一種表觀遺傳特征，幾乎涉及所有類型的腫瘤[17-19]。惡性腫瘤中有很多關鍵基因啟動子區(如參與DNA 修復、調節細胞周期、耐藥性形成及腫瘤浸潤、轉移和血管生成的基因)存在高甲基化狀態，這可能是腫瘤的特征之一。研究發現，在肝癌的發生發展過程中，某些病毒可引起抑癌基因啟動子區的高甲基化干擾抑癌基因的表達及轉錄，導致細胞異常增殖，引起細胞的癌變[20]。由于DNA甲基化與人類發育和腫瘤疾病的密切關系，特別是CpG島甲基化所致抑癌基因轉錄失活問題，DNA甲基化已經成為表觀遺傳學和表觀基因組學的重要研究內容。

肝癌是常見的原發腫瘤，具有易復發、轉移，死亡率高，預后差等特點[21].，且研究發現80%的肝癌與HBV感染有關[22-23]。所以了解和發現肝癌早期診斷的特異性生物學標志物以及尋找肝癌治療的新靶點具有重要意義。本實驗通過檢測KAI1在肝癌原發灶中的表達，分析其臨床特征，推測KAI1的異常表達可能參與了肝癌的發生、發展， 而HBV可能通過甲基化KAI1啟動子區抑制KAI1基因的表達進一步促進了肝癌發生發展。