電刺激分離蚯蚓及其對蚯蚓體內(nèi)生化指標的影響

王海候，孟祥國，金梅娟，施林林，周新偉，陸長嬰，沈明星

(江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所 農(nóng)業(yè)部蘇州水稻土生態(tài)環(huán)境重點野外科學觀測試驗站，江蘇 蘇州 215155)

蚯蚓是一種以腐敗有機物料為食的雜食性動物，在常溫有氧條件下吞食有機物，通過腸道物理破碎及微生物的協(xié)同作用對有機固體廢棄物進行生物氧化和轉化，形成富含腐殖質和營養(yǎng)元素的蚓糞有機肥[1-2]。目前，利用蚯蚓處理有機廢棄物已是一種新型的生態(tài)處理技術，蚯蚓生物消解技術已經(jīng)廣泛應用于畜禽糞便、城市污泥等有機固體廢棄物的生物處置工程，有效實現(xiàn)了有機固體廢棄物的資源化、減量化、無害化利用[3-7]。

現(xiàn)階段我國蚯蚓處理生物有機廢棄物技術比較成熟[8-12]，但是蚯蚓活體與蚓糞分離一直是蚯蚓處理廢棄物能力提高的關鍵技術瓶頸，在一定程度上影響了蚯蚓處理有機廢棄物潛力的發(fā)揮。分離蚯蚓活體與蚓糞的方法主要有人工法、光刺激法、滾輪振動法、誘捕法等[13-16]，但上述非人工輔助性方法成熟應用于生產(chǎn)實際的實例幾乎沒有。目前，蚯蚓處理有機廢棄物的后期，蚯蚓活體與蚯蚓糞分離采收工作仍然以手工操作為主，效率低、勞動力成本高。作者所在項目組研究發(fā)現(xiàn)，采用電刺激的方法可以實現(xiàn)蚯蚓活體與蚓糞的快速分離(正申請專利保護)，并且可以顯著提高勞動效率，降低勞動力投入成本，極大緩解了蚯蚓分離效率低下與有機廢棄物處置壓力大的矛盾。電刺激是否會造成蚯蚓生物機體組織損傷和功能障礙，也尚未可知。因此，本文擬研究應用電刺激方法分離蚯蚓與蚓糞過程中蚯蚓體內(nèi)生化指標的變化，旨在為一種利用電刺激分離蚯蚓活體與蚓糞的技術可行性提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試蚯蚓

選擇具有成熟環(huán)、健康活潑的赤子愛勝蚓作為供試蚓種。蚯蚓鮮質量0.25～0.30 g·條-1、長約5 cm。

1.1.2 供試物料

選擇蔬菜廢棄物、牛糞、秸稈作為供試有機物料。蔬菜廢棄物取自蘇州市相城區(qū)望亭鎮(zhèn)御亭現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園，主要為廢棄的果、葉、根莖、藤蔓等混合鮮樣，進行1～3 cm破碎(含水率84.7%、有機碳含量38.71%、全氮含量2.09%)；牛糞取自附近奶牛養(yǎng)殖場(含水率55.16%、有機碳含量34.07%、全氮含量1.12%)；秸稈取自附近農(nóng)場的水稻秸稈，進行0.2～0.5 cm粉碎(含水率20.19%、有機碳含量44.51%、全氮含量0.71%)。試驗首先堆制總重約1 000 kg，碳氮比約為25的蔬菜廢棄物混合堆肥體，將800 kg新鮮蔬菜廢棄物與100 kg牛糞、100 kg秸稈粉末充分混合，控制水分65%～75%，堆成垛狀并覆蓋薄膜，進行好氧堆制腐解10～14 d，備用。

1.2 處理設計

試驗于2018年10月在江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所實驗室內(nèi)進行。圍繞蚯蚓與蚯蚓糞快速分離的目標，項目組研發(fā)了一種利用電刺激分離蚯蚓的方法及裝置(正申請專利保護)。本試驗主要應用電刺激分離蚯蚓的方法及裝置，進行蚯蚓分離效果比較，以及蚯蚓生理生化指標對電刺激的響應。

1.2.1 電刺激分離蚯蚓、蚓糞的效果

以人工分離蚯蚓為對照，以電刺激分離蚯蚓為處理，每個處理各5次重復。取半腐解處理的有機物料100 kg，分別裝入2個相同大小的塑料整理箱(120 cm×50 cm×28 cm)中，每個整理箱的有機物料為50 kg，每箱投入蚯蚓2.5 kg，控制水分60%左右，置于避光陰涼處，培養(yǎng)21 d。培養(yǎng)結束后，將蚯蚓連同蚯蚓糞一起取出，分成10份，每份5 kg。其中5份分別裝入蚯蚓電刺激分離裝置，進行電刺激分離作業(yè)，另外5份分別置于塑料紙上，選用熟練工進行人工分離蚯蚓作業(yè)。每個處理的分離作業(yè)時間均為30 min，記錄第30 min時蚯蚓的分離數(shù)量，其余的蚯蚓均采用人工分離，記錄剩余的蚯蚓數(shù)量(包括成蚓、幼蚓及蚓繭數(shù)量)。

1.2.2 電刺激對蚯蚓生理生化指標的影響

以試驗1為基礎，共設3個處理，分別采集未電刺激分離的蚯蚓、電刺激分離的蚯蚓、電刺激分離后再恢復培養(yǎng)5 d的蚯蚓。其中，未電刺激分離的蚯蚓取試驗1中人工分離處理的蚯蚓，每個重復取50 g，待測；電刺激分離的蚯蚓取試驗1中經(jīng)歷電刺激(電流10 mA、刺激時間30 min)的蚯蚓，每個重復取100 g，平均分成2份，1份待測，1份置于有機物料中繼續(xù)進行恢復性培養(yǎng)5 d，再通過人工分離待測。每個處理重復5次，上述待測樣品先用超純水洗凈表面有機物料后，放入底部鋪有濕潤濾紙的2 L燒杯中，用無紡布封口，置于25 ℃人工氣候箱中，避光培養(yǎng)8 h，用于除盡蚯蚓腸道內(nèi)雜物等。最后置于-86 ℃超低溫冰箱保存待測。

1.3 指標檢測

1.3.1 蚯蚓分離效率

蚯蚓數(shù)包括了成蚓、幼蚓及蚓繭數(shù)量，指30 min內(nèi)分離的蚯蚓數(shù)占蚯蚓總數(shù)的比例。

1.3.2 蛋白含量及酶活力或含量的測定

蚯蚓樣品的蛋白含量及酶活力或含量測定，由南京鐘鼎生物技術有限公司測定完成。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍比色法測定，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、乙酰膽堿酯酶(AchE)、纖維素酶的活性、丙二醛(MDA)含量采用試劑盒法測定[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

蚯蚓分離效率、蚯蚓體內(nèi)生化指標由5組蚯蚓試驗樣本的平均值得到。數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理與畫圖，SPSS 23.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 電刺激對蚯蚓、蚓糞分離效果的影響

電刺激分離蚯蚓過程主要是將蚯蚓連同消解物料一起裝入生物反應器內(nèi)，待物料消解結束后，應用10 mA弱電流間歇式刺激30 min，蚯蚓在電刺激下逃離生物反應器，從而實現(xiàn)蚯蚓與蚓糞的分離。由圖1可知，在相同蚯蚓物料體質量、相同分離時間條件下，電刺激分離的蚯蚓分離率顯著大于人工方式，分離率提高了31.9百分點。

柱間無相同小寫字母表示處理間差異顯著(表3～5同)。圖1 不同分離方式對蚯蚓、蚓糞分離率的影響

電刺激處理的蚯蚓分離率隨著電刺激時間的增加呈上升趨勢(圖2)。蚯蚓分離率與電刺激時間呈極顯著性線性正相關，y=2.596x+10.115(r=0.997**)，說明分離率0～84.6%時，電刺激時間每增加1 min，蚯蚓分離率可提高2.6百分點。與人工分離方式相比，在蚯蚓應用于農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)消解工程中，當蚯蚓密度較高時，可以通過電刺激方式，實現(xiàn)蚯蚓密度的有效降低。

圖2 不同電刺激時間對蚯蚓、蚓糞分離率的影響

2.2 電刺激對蚯蚓體內(nèi)生化指標的影響

2.2.1 可溶性蛋白、MDA含量

蚯蚓在逆境脅迫條件下，機體功能和內(nèi)分泌系統(tǒng)受損，在短期內(nèi)會產(chǎn)生較多的應激蛋白去應對逆境脅迫負荷，從而引起體內(nèi)蛋白含量的升高[19-20]。如圖3所示，與對照相比，電刺激及電刺激5 d后的蚯蚓體內(nèi)可溶性蛋白含量均無顯著性差異，說明10 mA弱電流間歇式刺激30 min后，對蚯蚓體內(nèi)可溶性蛋白含量無顯著影響。MDA作為膜脂質過氧化物的產(chǎn)物，是細胞膜脂質過氧化程度及應激反應強弱的重要指示指標，MDA含量與機體損傷呈正比[21]。研究發(fā)現(xiàn)，電刺激顯著提高了蚯蚓體內(nèi)MDA含量，但電刺激后培養(yǎng)5 d，蚯蚓體內(nèi)MDA含量與對照無顯著性差異。

圖3 電刺激對蚯蚓可溶性蛋白及MDA含量的影響

2.2.2 SOD、CAT活性

生物體內(nèi)活性氧的消除主要是由抗氧化防御系統(tǒng)酶來完成，抗氧化防御系統(tǒng)酶主要有SOD、CAT、過氧化物酶(POD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、細胞色素過氧化物酶、NADH過氫化酶與氧化酶等，其中研究最多的是SOD、CAT[22]。SOD是消除細胞體內(nèi)生物氧化、產(chǎn)生超氧陰離子自由基的金屬酶類，是生物體內(nèi)重要的氧自由基消除劑[23]。如圖4所示，各處理組蚯蚓體內(nèi)SOD、CAT活性物無顯著性差異。

圖4 電刺激對蚯蚓SOD、CAT活性的影響

2.2.3 纖維素酶、AchE活性

蚯蚓作為一種植食性動物，是有機物質的分解者，蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶對土壤中有機物質的分解起著重要作用，纖維素酶活性越高，消解能力越強[24]。AchE在蚯蚓的神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用，AchE活性主要用于評價逆境因子對蚯蚓的脅迫情況，AchE活性越低，則蚯蚓神經(jīng)傳遞受阻，生命力則越差[25]。圖5所示，電刺激后蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性與對照組無顯著性差異；繼續(xù)培養(yǎng)5 d后，蚯蚓體內(nèi)的纖維素酶活性顯著高于對照組和電刺激組。各處理組蚯蚓AchE活性均無顯著性差異。

圖5 電刺激對蚯蚓纖維素酶、AchE活性的影響

3 討論

與對照處理相比，在相同物料體質量、相同分離時間下，電刺激處理的蚯蚓分離率顯著提高了31.9百分點。電刺激處理下蚯蚓分離率可達84.6%，且分離率0～84.6%時，電刺激時間每增加1 min，蚯蚓分離率可提高2.6百分點。蚯蚓在弱電流刺激及間隙式電場作用下分離，可能與蚯蚓在電刺激脅迫下產(chǎn)生不適感而應激逃跑，實現(xiàn)蚯蚓與蚓糞的分離，但有關電刺激措施對蚯蚓的負荷方式、作用機制等均尚不清楚，有待于進一步的研究。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，環(huán)境逆境脅迫對蚯蚓生化指標影響的研究已經(jīng)成為蚯蚓生態(tài)毒理學的研究熱點，利用蚯蚓的分子、生物化學和生理反應，即生物標志物指示逆境脅迫對蚯蚓所產(chǎn)生的影響，并作為早期應對逆境脅迫的預警監(jiān)測指標[26]。本試驗關注了蚯蚓經(jīng)電刺激處理后可溶性蛋白、MDA、纖維素酶、CAT、SOD、AchE等生化指標的變化情況，發(fā)現(xiàn)蚯蚓對電刺激脅迫具有耐受性，且影響在蚯蚓后期的培養(yǎng)中可以實現(xiàn)自我恢復[19-20]。另外，電刺激后培養(yǎng)5 d的蚯蚓體內(nèi)纖維素酶活性仍顯著高于對照，說明電刺激對蚯蚓機體功能及內(nèi)分泌的影響只是短暫的，并不影響其持續(xù)的生長與消解能力，有關電刺激處理后纖維素酶活性的促進作用原因，尚有待進一步研究。