轉基因大豆對土壤微生物區系的影響

劉慧璐，范巧蘭，王 慧，李永山，席吉龍，楊 娜，席天元，常鐵牛，陶民剛

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院棉花研究所，山西運城044000）

大豆最早起源于我國，是重要的油料作物和蛋白來源，因其營養豐富全面，在日常生產生活中扮演著重要角色。自1996 年開始商業化種植以來，轉基因作物已連續發展22 a。國際農業生物技術應用服務組織（ISAAA）顯示[1]，2017 年轉基因作物種植面積創造了1.898 億hm2的新紀錄，種植轉基因作物的國家增加到24 個，美國、巴西、阿根廷位列前3。其中，轉基因大豆的種植面積最大，超過9 400 萬hm2，占轉基因作物總面積的50%。大豆總面積的77%為轉基因大豆，而抗草甘膦轉基因大豆是主要品種。20 世紀我國仍是大豆出口國，但進入21 世紀后我國大豆進出口發生逆轉，2018 年全年進口大豆達9 000 萬t，是進口量最大的農產品。轉基因技術的快速發展，帶來了大量的經濟效益，解決了許多地區糧食不足的問題；但同時，轉基因作物的環境安全性也引起人們的關注[2-6]。

土壤處于巖石圈的表層，與地表環境緊密相連、息息相關。土壤微生物參與土壤物質傳遞和能量循環，可以表征土壤養分狀況和修復污染土壤[7-9]。轉基因技術將外源的目的基因轉入到本體內，改變了本體的農藝性狀或生理代謝，從而實現作物的高產高效[10]。轉基因作物大面積種植勢必會使得轉基因成分或者轉基因作物分泌物進入土壤，這可能會引起土壤微生物數量、群落結構和多樣性變動，進而影響土壤的生態環境[11]。國內外有很多關于轉基因作物對微生物影響的研究，但研究結果存在分歧。有研究結果顯示，轉基因作物對土壤特定微生物沒有影響；而有研究表明，轉基因作物改變了土壤微生物群落結構和多樣性[12-15]。目前，我國轉基因大豆還沒有進行商業化生產，但對轉基因大豆的生態安全風險已展開相關研究，關于轉基因大豆對土壤微生物研究主要集中在東北黑土區[10-11]。但研究的結論不一致。

本試驗采用盆栽和傳統平板培養計數法結合，對種植耐除草劑轉基因大豆的影響進行研究，旨在為轉基因大豆的環境安全評價提供一定科學參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為2 個耐除草劑轉基因大豆品種TN1和94Y20 以及1 個非轉基因大豆品種運豆101。

1.2 試驗設計

試驗在山西省農業科學院棉花研究所進行，采用盆栽試驗。盆栽所用土壤取自農場，土壤類型為黃壤土，速效氮、速效磷、速效鉀含量分別為65，7，86 mg/kg，有機質含量0.89%，pH 值7.12，未種植任何轉基因作物。試驗設3 個處理，每個處理代表一個品種，共有15 次重復。播種前，土壤自然風干，去掉石子、根系等雜質過5 mm 篩，充分混勻。每盆裝土7 kg，播前定量澆水，每千克土施用0.15 g N、0.1 g K2O 和0.1 g P2O5。2018 年5 月11 日播種，每盆播種2 粒品質好的種子，出苗后定苗1 株，定期定量澆水，每15 d 變換一次位置，并采取病蟲害防治措施。

分別在大豆苗期（6 月25 日）、花期（7 月18 日）、鼓粒期（9 月25 日）和成熟期（10 月9 日）采集根區土樣。每盆在根系周圍取3 鉆，去根系雜質混勻為一個重復，各生育期每個處理取3 次重復。裝入密封袋冷藏在4 ℃和－80 ℃冰箱內。

1.3 測定項目及方法

土壤微生物計數采用稀釋平板培養法，將土樣研磨加入無菌水，逐級稀釋至需要的倍數，接種至平板培養基涂抹均勻。采用不同培養基對土壤微生物進行分類，細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基，真菌采用馬丁培養基，放線菌采用高氏一號培養基，固氮菌和氨化細菌采用蛋白胨牛肉膏瓊脂培養基（配比不同），詳情參考文獻[18]。

1.4 數據分析

采用Excel 2010 進行數據整理，采用SPSS 20.0統計軟件進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因大豆對土壤細菌的影響

由表1 可知，3 種大豆土壤細菌數量隨生育進程逐漸增加，至鼓粒期達到最大，然后降低。其中，苗期，轉基因品種94Y20 和TN1 土壤細菌數量比運豆101 分別提高了70.59%和17.65%，但差異不顯著；花期細菌數量大小依次為94Y20＞運豆101＞TN1，三者差異不顯著；鼓粒期94Y20 和TN1 較運豆101 顯著降低了土壤細菌數量；成熟期94Y20 和運豆101 差異不顯著，但與TN1 差異均達顯著水平。4 個生育期內，轉基因大豆TN1 的細菌最少。

表1 轉基因大豆對土壤細菌的影響 ×106 cfu/g

2.2 轉基因大豆對土壤真菌的影響

從表2 可以看出，轉基因大豆94Y20 和非轉基因大豆運豆101 土壤真菌數量隨生育進程推進呈先增加后減少的變化趨勢，至花期達最多；TN1 土壤真菌數量不同生育時期變化不大；苗期TN1 土壤真菌數量高于94Y20 和運豆101，但差異不顯著；花期土壤真菌數量運豆101 和94Y20 顯著高于TN1，但94Y20 與運豆101 間差異不顯著；鼓粒期和成熟期，運豆101 土壤真菌數量略高于轉基因品種94Y20 和TN1，但三者差異均未達到顯著水平。

表2 轉基因大豆對土壤真菌的影響 ×104 cfu/g

2.3 轉基因大豆對土壤放線菌的影響

從表3 可以看出，3 個大豆品種放線菌數量隨生育進程推進上下波動，表現為先降低之后升高再降低，數量大小依次為鼓粒期＞成熟期＞苗期＞花期；苗期轉基因大豆TN1 和94Y20 土壤放線菌數量低于運豆101，但差異不顯著；花期，放線菌數量大小依次為TN1＞運豆101＞94Y20；鼓粒期放線菌數量大小依次為TN1＞運豆101＞94Y20；成熟期放線菌數量大小依次為TN1＞94Y20＞運豆101。3 個品種間各生育期差異均未達到顯著水平。

表3 轉基因大豆對土壤放線菌的影響 ×106 cfu/g

2.4 轉基因大豆對土壤固氮菌的影響

由表4 可知，3 種大豆土壤固氮菌數量在生育期內變化趨勢相似，苗期轉基因大豆94Y20 和TN1與非轉基因大豆相比，顯著提高了土壤固氮菌數量；其他生育期則相反，轉基因大豆品種94Y20 和TN1減少了固氮菌數量，但差異均未達到顯著水平。

表4 轉基因大豆對土壤固氮菌的影響 ×104 cfu/g

2.5 轉基因大豆對土壤氨化細菌的影響

由表5 可知，2 個轉基因品種土壤氨化細菌數量隨著生育進程推進呈先增加后降低的變化趨勢，至鼓粒期達到最高；非轉基因品種運豆101 土壤氨化細菌數量也是鼓粒期達到最大值，然后下降。苗期，與非轉基因品種運豆101 相比，2 個轉基因大豆降低了氨化細菌數量，且差異達到顯著水平；花期，土壤氨化細菌大小為TN1＞94Y20＞運豆101，但三者差異未達到顯著水平；鼓粒期土壤氨化細菌大小為94Y20＞運豆101＞TN1，但三者差異未達到顯著水平；成熟期土壤氨化細菌大小依次為TN1＞運豆101＞94Y20，但三者差異未達到顯著性水平。

表5 轉基因大豆對土壤氨化細菌的影響 ×105 cfu/g

3 結論與討論

土壤微生物是土壤生態系統的重要部分，轉基因作物對微生物具有潛在的影響。已有研究表明，轉入的抗逆等基因可通過作物組織凋落和分泌物滲透的形式進入土壤中[19]，進入微生物細胞內，經過遺傳發育可改變微生物的群落結構和多樣性[20]；或者轉入基因可改變受體的生理活動和農藝性狀，基因表達的蛋白組織和生理代謝產生的根系分泌物進入到土壤中，引起根區環境變化，從而對土壤微生物產生影響[20]。

陶波等[21]采用盆栽試驗研究轉基因大豆對根際和非根際土壤微生物數量的影響，結果發現，不同種植天數轉基因大豆與非轉基因大豆相比顯著增加或者減少微生物數量。劉佳等[22]采用室外小區和平板培養相結合研究發現，轉基因大豆降低了土壤細菌、放線菌和氨化細菌數量，提高了真菌數量。沈彬等[23]采用qPCR 和高通量測序研究分析轉基因大豆土壤細菌豐度和群落結構，結果發現，轉基因的大豆（G10-epsps）對土壤細菌優勢種群沒有影響，但增加了結莢期細菌的豐度和多樣性，改變了部分優勢種群的豐度。徐廣惠等[17]采用傳統培養研究轉基因大豆（RRS）對土壤細菌的影響，結果發現，RRS 降低了土壤細菌數量；采用DGGE-cloning方法研究發現，RRS 改變了細菌種群結構，說明轉基因大豆對土壤細菌有抑制作用。劉根林等[24]采用磷脂脂肪酸（PLFA）研究發現，轉基因大豆改變了花期土壤微生物群落結構。本研究得出，轉基因大豆TN1 和94Y20 顯著降低了鼓粒期細菌數量，改變了花期土壤真菌數量，這與徐廣惠和劉根林研究結果相似。王麗娟等[25]利用Biolog 技術研究轉基因大豆大田種植對土壤微生物群落功能多樣性的影響，結果表明，轉基因大豆（PAT 和ALS）對微生物群落均一度、優勢度和碳源利用類型無明顯差異，但微生物活性提高。

轉基因大豆對土壤放線菌影響不顯著，在個別生育期對細菌、真菌、固氮菌和氨化細菌有影響。但由于生態環境的復雜性和微生物群落的多樣性，需要結合多種研究方法對土壤微生物進行深入研究，以期得到更可靠的結論。