微孔淀粉對2,4-二硝基苯酚的負載與緩釋

楊 慧,樊艷葉,趙佩瑩,黃紅梨,鐘旋銘,林日輝,*,廖安平

(1.廣西民族大學化學化工學院,廣西多糖材料與改性重點實驗室培育基地, 廣西高校化學與生物轉化過程新技術重點實驗室,廣西南寧 530006; 2.廣西民族大學相思湖學院,廣西南寧 530006)

2,4-二硝基苯酚(DNP)是一種典型的線粒體氧化磷酸化解偶聯劑[1-2],20世紀30年代DNP作為一種減肥藥物在美國廣泛使用[3],1932～1938年期間的臨床研究顯示，服用DNP的患者出現了一系列副作用,包括白內障、胃腸道系統、心肺呼吸系統及其他類型的并發癥,甚至死亡[4]。因此,1938年DNP被美國食品和藥物管理局禁止使用[3,5]。但2001年,De Felice等[1]研究發現低濃度的DNP能阻止β-淀粉樣蛋白肽的聚集,對神經退行性病變具有一定治療作用,相對較高的劑量(35 mg/kg)下才會出現毒副作用,使DNP被重新關注。隨后的研究發現,低劑量的DNP(3～5 mg/kg)可使代謝率提高40%,同時對損傷的神經具有良好的修復作用,不會產生不良反應[6];超低劑量的DNP(0.5 mg/kg)下可以提高學習能力,且無任何副作用[4]。Qian等[7]發現利用低濃度DNP在小鼠肝細胞中產生溫和的解偶聯作用,可下調肥胖小鼠的糖尿病和脂肪肝基因。近年來的臨床前數據也顯示,低劑量的DNP可治療阿爾茨海默癥[8-9]、帕金森病[6,9]、癲癇[4,6]、視神經炎[10]、脊髓挫傷后繼發性損傷[11]和腦缺血性組織損傷[12]。但DNP是一種極性小分子,可以迅速被人體吸收,造成血藥濃度急劇升高引起副作用。因此,開發一種可緩慢釋放的口服DNP[6]藥物制劑具有重要意義。

淀粉作為天然高分子材料在醫藥領域的應用受到廣泛關注[13],其中微孔淀粉是一種新型的變性淀粉,由于其特殊的孔狀結構,微孔淀粉吸附和緩釋等性能優良[14],因此研發以微孔淀粉為載體的新型緩控釋藥物制劑具有廣闊的市場前景。本文以α-淀粉酶水解玉米淀粉制備的微孔淀粉作為DNP緩釋的載體,考察DNP在微孔淀粉上的吸附特征及DNP-微孔淀粉的緩釋性能,探索DNP在微孔淀粉上的負載/釋放作用方式及機理,為DNP的臨床應用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉(食品級) 廣西南寧旺蜀商貿有限責任公司;α-淀粉酶(酶活2210 U/mL) BR級,美國阿拉丁;2，4-二硝基苯酚(DNP) AR級，山東西亞化學工業有限公司；胃蛋白酶 BR級,北京索萊寶;胰蛋白酶 BR級,北京索萊寶;透析袋(MW 3500) 美國雷布斯;鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉等 均為國產AR級。

L400型高速冷凍離心機 日本日立;TU1901型紫外分光光度計 北京普析儀器;WGLL-65BE型電熱鼓風干燥箱 天津泰斯特;FE28型pH計 上海梅特勒;KJMR-IV型血液混勻器 江蘇天翎儀器;SHY-2A型恒溫水浴震蕩搖床 江蘇吉特實驗儀器;RT10型磁力加熱攪拌器 德國IKA。

1.2 實驗方法

1.2.1 玉米微孔淀粉的制備與表征 方祥[15]的方法,并根據實際情況做出適當調整,準確稱量1.00 g玉米淀粉(直徑在5～13 μm范圍內,目數在1100～3000目)于150 mL錐形瓶中,依次加入50 mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(50 mmol/L,pH6.4)、100 μLα-淀粉酶,在40 ℃恒溫搖床(150 r/min)中反應8 h。反應完成后,用布氏漏斗抽濾,收集淀粉,用蒸餾水洗滌3次,60 ℃烘箱中烘干,粉碎,過100目篩，備用。將原淀粉和微孔淀粉制成電鏡觀察樣品,采用場發射掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品表面形態表征。參考胡飛[16]的檢測微孔淀粉的吸油率。

1.2.2 DNP-微孔淀粉制備條件的優化

1.2.2.1 吸附性能研究 用pH為4.5的鹽酸溶液配制一定濃度(100、200、300、400、500 mg/L)的DNP溶液。將0.1 g微孔淀粉、3 mL DNP溶液加入到5 mL離心管中,將離心管放置于血液混勻器上,在恒溫培養箱中于一定溫度下(25、30、35、40、45 ℃)進行吸附反應(3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、90、120 min)。吸附完成后,用0.22 μm的微孔濾膜過濾,取上清液稀釋相應倍數,在261 nm波長下檢測吸光值[17]。由標準曲線方程(y=0.0483x-0.0348,R2=0.9995)計算各樣液中的藥物濃度Ce,并按式(1)計算微孔淀粉對DNP的吸附量[18]。

式(1)

式中,qe:微孔淀粉對DNP的吸附量;C0:DNP初始濃度(mg/L);Ce:吸附后DNP濃度(mg/L);V:溶液體積(L);m:微孔淀粉干重(g)。

1.2.2.2 吸附模型分析 在本實驗中,采用動力學模型(包括一級動力學、二級動力學和粒子內擴散動力學模型)對吸附時間為3、5、7、10、15、20、30、40、50、60、90、120 min的吸附量(DNP初始濃度為100、300、500 mg/L)實驗數據進行擬合分析;利用熱力學模型對吸附溫度為25、30、35、40、45 ℃的吸附量實驗(DNP初始濃度為100、300、500 mg/L)數據進行擬合分析。吸附常用的動力學及熱力學模型[18-19]見表1。

表1 吸附動力學及熱力學模型Table 1 Adsorption kinetics and model thermodynamic model

1.2.3 DNP-微孔淀粉的制備 參考趙建明[20]的方法，并根據實驗情況和實際情況作出適當修改。準確稱量0.1 g微孔淀粉于5 mL離心管中,加入3 mL一定濃度的DNP溶液,將離心管放置于血液混勻器上,30 ℃恒溫吸附反應1 h。吸附完成后將吸附溶液用布氏漏斗抽濾,收集淀粉于60 ℃烘干,得到一定吸附量即載藥量的DNP-微孔淀粉，以備緩釋實驗使用。

1.2.5 體外模擬緩釋 根據《中國藥典》[21]和李婷婷等[20]方法配制模擬體液,分別以500 mL pH1.2的模擬胃液(稀鹽酸溶液,含胃蛋白酶)和pH6.8的模擬腸液(磷酸緩沖液,含胰蛋白酶)為釋放介質,精確稱取0.5 g的DNP-微孔淀粉(載藥量為3.3085 mg/g)/原料藥溶液,加入5 mL相應介質裝入透析袋,于轉速100 r/min、(37±0.5) ℃懸浮釋放。分別于1、2、3、4、6、8、10、12和24 h取釋放介質5 mL(同時補充同溫等量相應介質),根據式(2)計算累計釋藥百分率Mt(%)。

式(2)

式中,Ci:第i次置換時釋放液中的DNP濃度(mg/L);D:DNP載藥量(mg/g);mdrug:DNP-微孔淀粉的質量(g);n:置換介質的次數;Ve:釋放介質置換體積(L);V0:起始釋放液體積(L)。

1.2.6 體外緩釋動力學分析 藥物體外釋藥模型的建立是緩釋藥物體外質量評價的重點。本文分別采用零級動力學、一級動力學、Higuchi及Peppas方程[14,21]對DNP-微孔淀粉的釋藥數據進行擬合分析。體外釋放動力學模型方程見表2。

表2 藥物體外釋放動力學模型Table 2 Kinetic model of drug release in vitro

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次重復,采用Excel 2010進行實驗數據統計,采用Origin(Pro 9.0)軟件對實驗參數和結果進行擬合分析及作圖。

2 結果與分析

2.1 微孔淀粉的形貌及特性分析

玉米淀粉經α-淀粉酶催化水解8 h得到微孔淀粉如圖1所示。與原淀粉相比,微孔淀粉的表面布滿了細密的小孔,即玉米淀粉經α-淀粉酶水解后產生了孔洞,孔徑范圍在0.8～1.5 μm。且微孔淀粉顆粒仍保持了原淀粉顆粒的不規則菱形結構。原淀粉的吸油率為80.08%,微孔淀粉的吸油率為170.33%,比原淀粉提高112.71%。所以可以作為吸附載體進行藥物緩釋。

圖1 電鏡分析圖Fig.1 Electron micrograph analysis注：A:原玉米淀粉500×;B:微孔淀粉500×。

2.2 DNP微孔淀粉制備條件的優化

2.2.1 吸附時間對微孔淀粉吸附DNP的影響及吸附動力學模型分析 為確定微孔淀粉吸附DNP的最佳吸附平衡時間,本文研究了吸附時間對微孔淀粉吸附DNP的影響,結果如圖2所示,在吸附時間在3～120 min范圍內,DNP初始濃度為100、300、500 mg/L,微孔淀粉對DNP的吸附呈相同趨勢。在DNP初始為300 mg/L時,在0～60 min吸附量迅速增加,吸附時間為60 min時,吸附量為2.4865 mg/g,60～120 min內吸附量僅增加0.8328%,所以,將60 min設定為為最佳吸附平衡時間。

吸附動力學模型常被用于描述吸附過程中吸附質在吸附劑上的吸附速率[19]。在本實驗中,采用一級動力學,二級動力學和粒子內擴散動力學模型對實驗數據進行擬合分析。結果如表3所示:二級動力學模型擬合結果R2>0.99,與一級動力學和粒子內擴散模型相比R2更接近1。且二級動力學擬合出的理論計算值qe,cal(1.1766、2.5506、3.3416 mg/g)更接近實驗值qe,exp(1.1594、2.4864、3.2236 mg/g)。所以,二級動力學模型更適用于描述微孔淀粉對DNP的吸附過程。說明微孔淀粉對DNP的吸附過程中不僅是物理吸附,而且可能有氫鍵等共同作用[22]。

表3 吸附動力學模型參數Table 3 Adsorption kinetic model parameters

2.2.2 吸附溫度對微孔淀粉吸附DNP的影響及吸附熱力學模型分析 吸附溫度對微孔淀粉吸附DNP的影響如圖3所示,在吸附溫度范圍內(25、30、35、40、45 ℃),微孔淀粉對DNP的吸附量隨溫度升高而降低。當吸附溫度由25 ℃提高到45 ℃,DNP初始濃度為100、300、500 mg/L的吸附量分別降低26.79%、24.22%、26.14%。可初步確定微孔淀粉對DNP的過程是放熱過程,降低溫度利于吸附量的提高。

圖3 反應溫度對吸附過程的影響Fig.3 Effect of temperature on the adsorption process

吸附熱力學模型常被用于分析溫度對吸附過程的影響,將吸附數據進行熱力學模型的擬合,結果見表4。在微孔淀粉吸附DNP的過程中ΔG0<0[23],表明該吸附是自發行為,且隨著溫度的降低|ΔG0|增大,表明降溫有利于吸附進行;隨著DNP濃度的升高,|ΔG0|逐漸減小,說明隨著吸附量的增加,吸附位點減少,吸附的驅動力減弱。韓雙艷等[24]曾報道ΔG0值在-20～0 kJ/mol之間的吸附過程為物理吸附。ΔS0<0[23,25]表明DNP被吸附到微孔淀粉上比在溶液中運動受到更大的限制,表明DNP在微孔淀粉上的排列更加緊密、有序。同時也說明焓變是此吸附過程中的主要驅動力。-10 kJ/mol<ΔH0<-7 kJ/mol,說明此吸附過程為放熱過程,與溫度對微孔淀粉吸附DNP的吸附量的影響結論一致。王龍等[25]認為|ΔH0|在0～29 kJ/mol和0～40 kJ/mol的吸附作用力分別為范德華力(包括色散力、誘導力及取向力)和氫鍵力。所以微孔淀粉對DNP的吸附為范德華力和弱氫鍵力共同作用的表面物理吸附。

表4 熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters

2.2.3 DNP的初始濃度對微孔淀粉吸附DNP的影響 DNP的初始濃度對微孔淀粉吸附DNP吸附量的影響趨勢如圖4所示。微孔淀粉對DNP的吸附量隨著DNP濃度(100～500 mg/L)的增加而增加。吸附溫度為45 ℃時,DNP的初始濃度為500、100 mg/L時吸附量分別為2.5383、1.0269 mg/g,吸附量提高了147.18%。在吸附時間為1 h、吸附溫度為25 ℃、DNP的初始濃度為500 mg/L時,微孔淀粉對DNP的最大吸附容量為3.4369 mg/g。

圖4 DNP初始濃度對吸附過程的影響Fig.4 Effect of initial concentration of DNP on adsorption process

2.3 DNP-微孔淀粉的吸附量

因實驗條件限制，本文緩釋實驗中所用的DNP-微孔淀粉是選用DNP初始濃度為500 mg/L，吸附溫度為30 ℃，吸附時間為1 h所制備吸附量即載藥量為3.3085 mg/g的DNP-微孔淀粉。

2.4 體外模擬緩釋結果

DNP-微孔淀粉在模擬腸液和模擬胃液的體外緩釋結果如圖5。

圖5 體外模擬釋放曲線Fig.5 In vitro simulated release profile注：A:模擬胃液,B:模擬腸液。

可以明顯看出,原料藥在模擬胃液中4 h完全釋放,釋放率為92.23%,在模擬腸液中3 h完全釋放,釋放率達91.38%。所以口服DNP可被迅速吸收,短時間達到高血藥濃度,引起副作用。DNP-微孔淀粉在人工胃液和腸液中釋放3 h釋藥率分別為38.58%和78.23%,可短時間內達到有效血藥濃度;在4～12 h釋藥速率減慢,此時可維持體內有效血藥濃度,且不會產生毒副作用[22]。12 h后微孔淀粉負載的DNP藥物完全釋放,在模擬胃液和模擬腸液中釋藥率分別達91.18%和89.29%。說明DNP經微孔淀粉負載后的緩釋性能明顯。

2.5 體外緩釋動力學分析

分別以模擬腸液和模擬胃液為釋藥介質進行DNP-微孔淀粉體外緩釋試驗,用藥物釋放零級方程、一級方程、Higuchi方程和Peppas方程對釋藥率進行動力學模型擬合,得出各擬合動力學方程,以判斷釋放機制,結果見表5。在模擬胃液中的緩釋數據顯示,一級釋放動力學方程擬合的相關性(R2=0.9902)優于零級(R2=0.9680)、Higuchi(R2=0.9868)和Peppas(R2=0.9898)方程,說明一級釋放動力學方程更接近實驗值,能更好地描述DNP在人工模擬胃液中的累積釋放量與時間的關系;在模擬腸液中的緩釋結果顯示，相比零級動力學(R2=0.7545)、一級釋放動力學(R2=0.9212)和Higuchi(R2=0.8948)方程，更適合用Peppas動力學方程(R2=0.9525)描述DNP在人工模擬腸液中的累積釋放量與時間的關系。Peppas方程中B為擴散指數,能夠用來解釋載藥微球的釋藥機制,當B<0.43時,藥物釋放以Fickian擴散為主,當0.430.85時,藥物釋放以溶蝕為主[26]。在模擬腸液中的緩釋B為0.2124,小于0.43,即DNP的釋放以Fickian擴散為主[27];在模擬胃液中的緩釋B為0.7461,0.43

表5 DNP-微孔淀粉體外釋放動力學方程Table 5 In vitro release kinetics equation of DNP microporous starch

3 結論

利用α-淀粉酶水解玉米淀粉制備出了微孔淀粉。以微孔淀粉為載體對DNP進行吸附,吸附時間為1 h后達到吸附平衡,降低吸附溫度或增加DNP的初始濃度能有效提高DNP負載量。當吸附溫度為25 ℃、DNP的初始濃度為500 mg/L、吸附時間為1 h時,微孔淀粉對DNP的最大吸附容量為3.4369 mg/g。動力學及熱力學模型擬合結果表明，微孔淀粉對DNP的吸附過程是范德華力和氫鍵力共同作用的表面物理吸附。其中動力學模型顯示，此吸附過程符合二級動力學模型,熱力學參數ΔG0、ΔS0、ΔH0表明微孔淀粉對DNP的吸附過程是可自發進行的放熱過程,焓變是主要驅動力。體外緩釋實驗中,DNP-微孔淀粉在12 h后DNP才能釋放完全,在模擬胃液和模擬腸液的釋藥率分別為91.18%和89.29%,與原料藥相比DNP-微孔淀粉具有良好緩釋作用。在緩釋動力學擬合中,DNP-微孔淀粉在人工模擬胃液中的緩釋行為更適合用一級動力學模型來描述,為非Fickian擴散為主(即藥物通過擴散和溶蝕協同作用釋藥);在模擬腸液中的緩釋數據更符合Peppas方程,遵循Fickian的擴散機理。因此,利用微孔淀粉作為載體對DNP進行緩釋,將為降低口服DNP的毒副作用提供理論方案,對臨床上DNP應用于神經損傷性疾病及神經退行性病變的治療方面起到積極的推動作用。