腌韭菜根中腐敗菌的分離鑒定及防腐劑對其抑制作用

胡秀虹,李 培,2,鄧先銀,王 翔,2,*,張廷輝

(1.凱里學院大健康學院,貴州凱里 556011; 2.黔東南民族藥綜合利用工程技術研究中心,貴州凱里 556011; 3.黔東南州食品藥品檢驗檢測中心,貴州凱里 556011)

韭菜根是百合科蔥屬多年生草本植物寬葉韭(AlliumhookeriThwaites)(又稱大葉韭)的肉質根,其味辛、性溫,富含胡蘿卜素、蛋白質、氨基酸、維生素等營養成分及硒、鋅、錳、鈣、鐵等多種人體必需的微量元素,有溫中開胃、行氣活血、補腎助陽等功效[1-3]。腌韭菜根是貴州黔東南的一款地方特色食品,是采集貴州境內原生態韭菜根,經洗凈曬干后拌以輔料或腌制、罐裝,味道非常鮮美[4-6]。近年來,隨著貴州經濟的發展,旅游業及我國大健康產業快速興起,韭菜根原生態食品以其保健功效、獨特的風味,逐漸得到推廣和人們的認可。

然而,韭菜根原料水分含量高，營養豐富,極易因滋生微生物而腐敗,且韭菜根加工所用輔料種類較多、來源復雜,生產企業基礎薄弱、環境條件差、技術落后,生產過程中的微生物源頭和二次污染均難以控制。相關文獻報道[7-9],致使蔬菜腌制品腐敗的微生物主要是芽孢桿菌屬和酵母菌,其中大多數為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)。添加防腐劑是目前市場上最常使用的防腐保鮮方法之一,防腐劑能抑制食品中微生物的生長繁殖,防止食品變質腐敗,從而延長食品的保質期和貨架期[10-11]。目前,關于韭菜根腌制品中腐敗微生物的相關研究還未見報道,故本研究以脹袋變質的真空包裝韭菜根為原料,從中分離篩選出優勢腐敗菌,通過形態學特征、生理生化試驗和16S rRNA基因序列分析鑒定引起真空包裝韭菜根變質腐敗的主要微生物,并考察幾種常用防腐劑對其抑制作用,以期為腌韭菜根生產過程的質量控制提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腌韭菜根(原材料經滅菌真空包裝后脹袋變質) 貴州麻江裕沃生態農業發展有限公司;營養瓊脂培養基(Nutrient Agar,NA)培養基、營養肉湯(Nutrient broth,NB)培養基 北京奧博星生物技術有限責任公司;防腐劑(EDTA、苯甲酸鈉、焦亞硫酸鈉、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉,均為食品級) 南通奧凱生物技術開發有限公司;瓊脂糖 上海玉博生物科技有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒、通用引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)、1492R(5′-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) 上海生工生物工程股份有限公司。

SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺 鄭州宏朗儀器設備有限公司;GZX-158A型智能光照培養箱、LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海中安醫療器械廠;DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠;Gel DOC XT凝膠成像系統儀 美國BIO-RAD;2720 thermal cyclerPCR儀 Applied Biosystems;倒置光學顯微鏡 日本Olympus;S-3400N掃描電鏡 日本日立公司;LGJ-100四環冷凍干燥機 北京四環科學儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腐敗細菌的分離純化與篩選 在無菌操作下,分別從5包脹袋變質的腌制韭菜根中隨機取樣25 g,剪碎,放入裝有225 mL無菌生理鹽水的無菌均質袋中,用無菌均質器拍擊均質5 min(拍擊速度為8次/s),制成1∶10的樣品勻液。將樣液按10倍依次進行梯度稀釋,分別從10-2、10-3樣液中吸取0.1 mL置于NA培養基上涂布,37 ℃培養24 h,從NA平板上挑取典型生長的單菌落并反復劃線純化,獲得單菌株。將分離純化得到的各菌株平板活化培養12 h,挑起菌體用無菌水制成菌懸液,使菌體濃度約為105～106cfu/mL。

將滅菌后的韭菜根浸于各單菌種菌懸液中,10 s后取出晾干,再置于無菌袋中真空包裝,以未接腐敗菌的韭菜根作對照,37 ℃恒溫保存20 d。從是否發生脹袋及韭菜根感官變化方面進行比較,使韭菜根樣品較快腐敗的接種菌株作為優勢腐敗菌。

1.2.2 腐敗細菌的菌種鑒定

1.2.2.1 形態學及生理生化鑒定 參照《微生物學實驗教程》[12]操作,將已純化的菌株接種至NA培養基,37 ℃培養18～24 h后觀察其菌落形態特征并進行革蘭氏染色及芽孢染色試驗。參照文獻[13]制備細菌掃描電鏡樣品,觀察菌體形態。參照《微生物學實驗》[14]和《常見細菌系統鑒定手冊》[15]進行部分生理生化實驗。

1.2.2.2 16S rRNA基因序列測定 按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作提取細菌基因組DNA,采用1%瓊脂糖電泳檢測DNA提取質量和片段大小。采用通用引物27F和1492R,以細菌基因組DNA為模板,進行16S rRNA序列擴增。擴增反應體系(25 μL):基因組DNA 0.5 μL,10×Buffer(Mg2+)2.5 μL,引物(20 pmol/μL)各0.5 μL,Taq DNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL,加ddH2O至25 μL。反應條件為:94 ℃ 4 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,30個循環;72 ℃ 10 min。PCR產物經凝膠電泳分析后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果用GenBank中的Blast進行同源性比較,通過Clustal X軟件進行多序列比對,MEGA 5.0軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.2.3 防腐劑對腐敗細菌的抑制研究 根據國家標準GB 2760-2014《食品添加劑使用標準》[16]和相關報道結果[10],選擇苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉、EDTA、山梨酸鉀、焦亞硫酸鈉作為防腐劑,以無菌生理鹽水配制質量濃度為500 μg/mL的防腐劑母液,0.22 μm無菌濾膜過濾除菌,結合實際生產使用情況,防腐劑的名稱及具體添加濃度如下:

比濁法[10]:將試驗的各菌株活化培養后用營養肉湯培養基稀釋,使培養基中的菌株初始菌量為500 CFU/mL,按表1各防腐劑的添加濃度加入一定量的防腐劑母液至培養基中,將其置于37 ℃下搖床培養24 h,以接種菌株但不加防腐劑為對照組,然后于600 nm下測定其OD值,平時試驗三次,并計算抑制率。

表1 5種防腐劑的質量濃度Table 1 Mass concentration of five preservatives

1.3 數據處理

根據上述公式分別計算各防腐劑不同濃度對腐敗菌株的抑制率,并將其轉化為概率值。利用Excel 2010計算出各防腐劑的毒力回歸方程、IC50及其RSD值。

2 結果與分析

2.1 腐敗細菌的分離篩選

通過稀釋涂布及平板劃線培養從脹袋變質的腌韭菜根中分離純化出17株單菌落,經多次傳代培養篩選,有11株長勢良好,其菌落形態穩定。致腐能力測試發現編號為XB1、XB2、XB9、XB10、XB11的菌株使韭菜根腐敗的較快,其中XB1、XB9可使真空包裝腌韭菜根在15 d內發生脹包,XB2、XB10、XB11使韭菜根色澤變暗。

2.2 腐敗細菌的形態及生理生化鑒定

表2是5株腐敗細菌的菌落形態結果。由表2可知,篩選出的5株腐敗細菌的菌落從形狀、大小、顏色、隆起度、表面質地及邊緣等方面均存在一定的差別,如XB1菌落大且呈擴展形,中間乳白邊緣淺黃透明,粘稠;XB2菌落的特點是灰白色,邊緣缺刻狀;XB9菌落,乳白色粘稠,菌落表面培養初期光滑后期發生褶皺;XB10菌落,淺黃色,呈凸透鏡狀隆起;XB11菌落的特征最明顯,菌落大且不規則,扁平,油脂質地,表面褶皺邊緣呈波狀。圖1為各株腐敗菌的掃描電鏡結果,A、B、C、D、E分別表示菌株XB1、XB2、XB9、XB10、XB11。XB1菌體呈棒桿狀,表面光滑、無鞭毛、無纖毛、產芽孢;XB2菌體呈短桿狀,表面不光滑、無鞭毛、有纖毛、產芽孢;XB9菌體呈球桿狀,表面光滑、無鞭毛、無纖毛、產芽孢;XB10菌體呈球桿狀,表面光滑、無鞭毛、無纖毛、產芽孢;XB11菌體呈桿狀,表面褶皺有凹陷、無鞭毛、無纖毛、產芽孢。菌株的菌落及菌體形態在一定程度上會受到培養條件、培養時間、傳代次數等因素的影響,且有些菌株在生長過程中會出現較明顯的球桿變化。各株腐敗菌的部分菌體形態學特征和生理生化試驗結果分別見表3和表4。由表3可知,所有腐敗菌株均為革蘭氏陽性產芽孢桿菌。表4結果表明,所有腐敗菌株均能水解淀粉;除XB9和XB11外,其他三株菌接觸酶反應陽性,表明其能產生過氧化氫酶;除XB10外,其余菌株硝酸鹽還原陽性,表明這些細菌能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;XB2、XB10、XB11菌株能液化明膠,表明這些菌株具有較強的水解蛋白質的能力;所有菌株都具有一定的糖發酵產酸或產氣的能力。由此推測,具有產氣能力的菌株是引起韭菜根產品脹袋的主要腐敗菌,產酸和產吲哚菌株是導致韭菜根異味的主要腐敗菌,產酶菌株會導致韭菜根軟化,具有水解淀粉和蛋白質能力的菌株會影響韭菜根品質,降低其營養價值。根據已有報道[7-8,17]結合上述實驗結果綜上分析,真空包裝腌韭菜根中的5株腐敗細菌可初步確定為芽孢桿菌屬。

表2 腐敗菌的菌落形態特征Table 2 Colony morphology characteristics of spoilage bacteria strains

圖1 腐敗菌的掃描電鏡照片Fig.1 Scanning electron microscopy of spoilage bacteria strains

表3 腐敗菌的菌體形態特征Table 3 Morphology characteristics of spoilage bacteria thallus

表4 腐敗細菌的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of spoilage bacteria strains

2.3 分子生物學鑒定與系統發育樹構建

經測序,5株腐敗細菌的16S rRNA基因序列大小約為1500 bp,均符合細菌16S rRNA序列長度。將各菌株序列在NCBI網站上進行比對,利用MEGA5.0軟件分析其與芽孢桿菌屬內相關種的同源性,構建系統發育進化樹,結果見圖2。由圖2可知,發育樹中XB1、XB9、XB10的16S rRNA序列與Bacillus中的B.megaterium(GenBank登錄號為KC477208.1)在同一個分支上,親緣關系最近;XB2、XB11的16S rRNA序列與B.toyonensis(GenBank登錄號為KX458036.1)在同一個分支上,親緣關系最近;其序列相似性均大于99%。另外,從圖2可以看出,菌株XB1、XB9、XB10與B.megaterium聚為一簇的可信度為86%,菌株XB2、XB11與B.toyonensis聚為一簇的可信度為100%。綜上,XB1、XB9、XB10可鑒定為B.megaterium;XB2、XB11鑒定為B.toyonensis。不過,同一種屬的XB1、XB9、XB10及XB2、XB11在生理生化及形態上均有細微差別,分析原因可能是環境條件導致了菌種的變異,致使其某些性能的改變,其分類學地位的最終確定仍需利用DNA-DNA分子雜交。

圖2 腐敗菌的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of spoilage bacteria strains

2.4 防腐劑對腐敗細菌的抑制試驗結果

由表5～表9可以看出,不同防腐劑對5株腐敗菌的抑制效果有明顯差異。苯甲酸鈉的IC50為5.63～10.11 μg/mL,山梨酸鉀的IC50為11.24～31.33 μg/mL,脫氫乙酸鈉的IC50為10.07～18.60 μg/mL,EDTA的IC50為20.68～40.70 μg/mL,焦亞硫酸鈉的IC50為15.74～36.37 μg/mL。一般IC50值越大,表明越安全,其抑制作用就越差。由此可知,苯甲酸鈉、脫氫乙酸鈉對5株腐敗菌具有普遍較好的抑制效果,其次是山梨酸鉀,而焦亞硫酸鈉、EDTA對5株腐敗菌整體均表現出較弱的抑制作用。則不同防腐劑對同一種腐敗菌的抑制效果有明顯差異,同一種防腐劑對不同種屬腐敗菌的抑菌效果不同且對同種細菌的不同菌株的抑菌效果也存在差異,這與相關研究報道一致[17]。

表5 不同防腐劑對XB1菌株的毒力Table 5 Toxicity of different preservatives to XB1 strain

表6 不同防腐劑對XB2菌株的毒力Table 6 Toxicity of different preservatives to XB2 strain

表7 不同防腐劑對XB9菌株的毒力Table 7 Toxicity of different preservatives to XB9 strain

表8 不同防腐劑對XB10菌株的毒力Table 8 Toxicity of different preservatives to XB10 strain

表9 不同防腐劑對XB11菌株的毒力Table 9 Toxicity of different preservatives to XB11 strain

3 結論與討論

本研究從脹袋變質的腌韭菜根中分離篩選出5株優勢腐敗細菌,經鑒定全為芽孢桿菌屬,初步確定由3株Bacillusmegaterium和2株Bacillustoyonensis組成,其分類學地位的最終確定仍需利用DNA-DNA分子雜交。經革蘭氏染色,5株腐敗菌均為陽性,其中XB1不產酸產氣,XB9產酸產氣,XB2、XB10、XB11產酸不產氣。防腐劑抑菌試驗表明,不同防腐劑對同一種腐敗菌的抑制效果有明顯差異,同一種防腐劑對不同種屬腐敗菌的抑菌效果不同且對同種細菌的不同菌株的抑菌效果也存在差異,綜合分析抑菌效果從高到低依次為:苯甲酸鈉>脫氫乙酸鈉>山梨酸鉀>焦亞硫酸鈉>EDTA。

微生物生長繁殖是導致真空包裝腌韭菜根腐敗脹包的主要原因。本研究分離獲得的腐敗菌種類及特征與以往的報道相符,同時也存在區別[7-9]。Bacillusmegaterium為常見食品腐敗菌,而Bacillustoyonensis在食品腐敗微生物研究的文獻中未見報道,但Kantas等[18]報道該菌種是蠟狀芽孢桿菌的一種自然發生的非產毒性非致病性菌株,可作為仔豬的飼料添加劑,還能提高綿羊對牛皰疹病毒5型疫苗的免疫應答[19],張立強等[20]曾從熱帶雨林土壤中分離得到并證明其具有抗根結線蟲活性。此外,化學合成防腐劑的安全性一直備受質疑,故后期研究可考慮天然、安全、高效的天然防腐劑[11,21]。本研究分離得到的腐敗菌,可作為腌韭菜根的防腐保鮮處理中的目標菌,為下一步進行腐敗過程中的感官與品質變化、天然防腐劑的篩選與應用以及滅菌工藝研究提供有價值的指導。