響應面優化二階段法粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素工藝

闕發秀,陳 鋼,郭月山,鄭淑丹,簡素平,萬 聆

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

番茄紅素(lycopene)是一種具有11個共軛雙建的β-類胡蘿卜素,具有強抗氧化性[1-2]。同時,番茄紅素能夠降低胃癌[3]、宮頸癌[4]、皮膚癌[5]等癌癥的風險,具有抗突變等作用[6],在食品、醫藥和化妝品等行業具有重要的應用價值。

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)營養要求低、菌絲生長快。目前,利用粗糙脈孢菌液體搖瓶發酵所產番茄紅素產量較低[7],雖然李陳陳等[8]通過固態發酵能顯著提高番茄紅素的產量,但是關于固態發酵的可用生物反應器設計較少[9],很難實現擴大培養。粗糙脈胞菌產生的番茄紅素主要集中于分生孢子中[10-11]。液體搖瓶培養對絲狀真菌氣生菌絲分化產生分生孢子有抑制和延遲作用[12],雖然菌絲暴露于空氣中時能誘導菌絲產孢[13],但菌絲必須經過一段時間的生長后才能獲得應答外界誘導信號的能力[14]。二階段培養是通過搖瓶培養讓菌絲經過一段時間的生長后,再通過靜止培養讓菌絲漂浮于液面上接觸空氣產生氣生菌絲進行誘導產孢的一種方法。研究報道,二階段培養法能顯著提高孢子產量和相應的代謝產物[15]。

本試驗研究了二階段培養法對粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素的影響和通過優化發酵條件提高了番茄紅素的產量,為微生物液體發酵產番茄紅素和孢子內代謝產物的工業生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa)3.1607 本實驗室-4 ℃冰箱保藏;番茄紅素標品 純度≥98%,美國Sigma公司;二氯甲烷、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯、丙酮 分析純,天津恒興化學試劑制造有限公司;葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4、KCl、FeSO4、K2HPO4分析純,天津市大茂試劑廠;種子培養基 PDA培養基;發酵培養基 取一定質量含54.54%葡萄糖、36.36%蛋白胨、0.91% MgSO4、0.91% KCl、0.02% FeSO4、5.45% NaNO3、3.0% K2HPO4的培養基加蒸餾水配成不同濃度的發酵培養基,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

ZHP-160型智能恒溫振蕩培養箱 上海三發科學儀器有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機 湖南湘實驗室儀器開發有限公司;GXD系列型自動恒溫鼓風干箱 上海紅聯機械電器制造有限公司;Agilent1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SW-CJ-1B標準凈化工作臺 蘇州凈化儀器廠;SB-5200DT型超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養 將菌種置于PDA斜面培養基30 ℃活化培養48 h之后,挑取4環菌種接種到裝有60 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中混勻,然后按5%的接種量接入裝有50 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養24 h后靜止培養84 h。發酵結束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質量。

1.2.2 番茄紅素的提取與測定

1.2.2.1 番茄紅素的提取 將烘干后的菌體轉移至研缽中,加入適量的石英砂,充分研磨后加入10 mL體積比為2∶3的乙酸乙酯-丙酮混合液,超聲波處理20 min(200 W,25 ℃)后暗室提取2.5 h,經0.22 μm微孔濾膜過濾,得到色素浸提液,每組做3個平行,HPLC檢測番茄紅素含量[16]。

1.2.2.2 高效液相色譜色譜條件 色譜柱為Agilent Ecllpse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm);Binary高效泵;流動相為乙腈-二氯甲烷(60∶40,V/V);檢測波長為472 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫28 ℃;進樣量10 μL[17]。

1.2.2.3 番茄紅素標準曲線制作 精密稱取1 mg的番茄紅素標準品,用乙酸乙酯-丙酮2∶3 (V/V)溶液溶解,定容于10 mL的棕色容量瓶中,得到質量濃度為100 μg/mL的溶液。逐級稀釋為0、20、40、60、80、100 μg/mL的番茄紅素標準溶液[18]。在“1.2.2.2”色譜條件下測定番茄紅素的峰面積,根據番茄紅素標準品的保留時間作定性分析,以各濃度為縱坐標(Y),峰面積為橫坐標(X)進行線性回歸計算,得番茄紅素標準品回歸方程:y=24.246x+51.938(R2=0.9988)。

1.2.2.4 番茄紅素產量的計算

式中:y表示樣品中番茄紅素的峰面積,v1為浸提液體積,v2為發酵液體積。

1.2.3 單因素實驗設計 預實驗中,研究了培養基濃度、搖瓶培養時間、靜止培養時間、接種量、溫度、搖瓶速率6個因素對番茄紅素產量的影響,其中培養基濃度、搖瓶培養時間、靜止培養時間、接種量是二階段培養法過程參數中影響較為顯著的因素。因此,本實驗選取了以上4個因素進行單因素實驗,實驗平行3次,結果取平均值。

1.2.3.1 培養基濃度對番茄紅素產量的影響 在搖瓶培養時間為18 h、靜止培養時間為84 h、接種量5%的條件下,考察培養基濃度為11、22、33、44、55 g/L對二階段培養粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素的影響。

1.2.3.2 搖瓶培養時間對二階段培養粗糙脈孢菌番茄紅素產量的影響 在培養基濃度為33 g/L、接種量5%、靜止培養時間為84 h的條件下,考察搖瓶培養時間為12、18、24、30、36 h對二階段培養粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素的影響。

1.2.3.3 靜止培養時間對二階段培養粗糙脈孢菌番茄紅素產量的影響 在培養基濃度為33 g/L、接種量5%、搖瓶培養時間為18 h的條件下,考察搖瓶培養時間為60、72、84、96、108 h對二階段培養粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素的影響。

1.2.3.4 接種量對二階段培養粗糙脈孢菌番茄紅素產量的影響 在培養基濃度為33 g/L、搖瓶培養時間為18 h、靜止培養時間為84 h的條件下,考察接種量3%、4%、5%、6%、7%對二階段培養粗糙脈孢菌發酵產番茄紅素的影響。

1.2.4 響應面試驗 在單因素試驗的基礎上,采用Box-Behnken設計原理,以培養基濃度、搖瓶培養時間、靜止培養時間和接種量為自變量,番茄紅素產量為響應指標進行響應面設計,Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

1.2.5 二階段培養法與搖瓶培養法對菌體干質量和番茄紅素產量的影響

1.2.5.1 二階段培養法對菌體干質量和番茄紅素產量的影響 按5%的接種量接入裝有50 mL 35 g/L的發酵培養基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養19 h后靜止培養87 h。發酵結束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質量和提取測定番茄紅素的產量,記為二階段培養法條件下菌體干質量和番茄紅素產量。

1.2.5.2 搖瓶培養法對菌體干質量和番茄紅素產量的影響 參照耿英龍等[7]的液體培養條件,按6.5%的接種量接入裝有50 mL 55 g/L的發酵培養基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養110 h。發酵結束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質量和提取測定番茄紅素的產量,記為搖瓶培養法條件下菌體干質量和番茄紅素產量。

1.3 數據分析

所得數據均為3次平行測定的平均值,采用Origin 8.5統計分析軟件、Design Expert 8.0.6軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養基濃度對二階段法培養粗糙脈胞菌發酵產番茄紅素的影響 由圖1可知,菌體干質量隨著培養基濃度增大而增大,當培養基濃度大于44 g/L時,菌體干質量保持穩定。培養基濃度增大即營養物質的濃度增大促進了菌體的生長繁殖;當培養基濃度達到44 g/L以后,進一步增大培養基濃度對菌體干質量無影響。隨著培養基濃度增大番茄紅素的產量增大,當培養基濃度為33 g/L時番茄紅素的產量達到最大。當超過33 g/L,番茄紅素的產量呈下降趨勢,可能是因為營養物質濃度較大,抑制了孢子的產生[12],導致番茄紅素的產量下降。

圖1 培養基濃度對菌體干質量和番茄紅素產量的影響Fig.1 Effects of medium concentration on dry cell weight and lycopene production

2.1.2 搖瓶培養時間對二階段法培養粗糙脈胞菌發酵產番茄紅素的影響 由圖2可知,菌體干質量隨著搖瓶時間延長而增大,當搖瓶培養時間超過30 h時,菌體量較多發酵液粘稠,靜止培養時發酵液中溶氧不足,菌體自溶導致菌體干質量下降。番茄紅素產量隨著搖瓶培養時間延長而增大,于18 h峰值為(18.65±0.24) mg/L。產孢是經過一段時間的營養生長才進行[14],當搖瓶時間較短時,菌體營養生長不足,可能導致番茄紅素的產量較低。18 h后呈下降趨勢,可能是因為隨著搖瓶時間延長,總培養時間延長,番茄紅素轉換為代謝終產物β-胡蘿卜素[19]。

圖2 搖瓶培養時間對菌體干質量和番茄紅素產量的影響Fig.2 Effects of shake culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.3 靜止培養時間對二階段法培養粗糙脈胞菌發酵產番茄紅素的影響 由圖3可知,靜止培養時間對菌體干質量影響不大,主要是因為靜止培養時發酵過程中的傳質效果差。靜止時間超過96 h,菌體干質量開始下降,可能因為菌體培養進入衰退期,菌體開始自溶。隨著靜止培養時間延長,番茄紅素產量增大,于靜止培養84 h產量最大,隨后呈下降趨勢,主要是因為番茄紅素轉換為代謝終產物β-胡蘿卜素[19]。

圖3 靜止培養時間對菌體干質量和番茄紅素產量的影響Fig.3 Effects of static culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.4 接種量對二階段法培養粗糙脈胞菌發酵產番茄紅素的影響 由圖4可知,在接種量分別為5%和6%時,番茄紅素產量和菌體干質量最大,菌體干質量和番茄紅素產量均隨接種量增大而增大,隨后減小,可能是因為接種量大,菌體繁殖過快、過稠不利于番茄紅素的產生,同時菌團懸浮于培養液中使下層培養基溶氧降低,進而影響菌體生長。

圖4 接種量對菌體干質量和番茄紅素產量的影響Fig.4 Effects of inoculum quantity on dry cell weight and lycopene production

2.2 響應面試驗方案設計與結果分析

根據單因素實驗結果,根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理,采用響應面分析法,以番茄紅素產量為考察指標,利用 Design Expert 8.0.6軟件在四因素三水平上對二階段法培養粗糙脈孢菌產番茄紅素的發酵條件中的影響因素:培養基濃度、搖瓶培養時間、靜止培養時間、接種量進行優化,確定最佳的發酵條件。試驗設計及結果見表2,方差分析結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗方案及試驗結果Table 2 Experiment design and resultsTable of Box-Behnken

表3 方差分析結果表Table 3 Results of variance analysis

利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗設計結果做回歸分析,得到響應值番茄紅素產量(Y)對編碼自變量A、B、C和D的二元多項回歸方程預測模型為:Y=19.72+0.62A+0.85B+1.05C+0.13D-0.57AB+0.075AC-0.087AD-0.11BC-0.25BD+0.045CD-1.9A2-2.27B2-2.03C2-1.05D2

2.2.1 各因素之間的交互作用 響應面圖和等高線圖可以形象地反映出各因素之間的相互作用和最佳參數。等高線圖呈圓形說明兩因素之間的交互作用不明顯,呈橢圓形說明兩因素之間的交互作用極為顯著[20]。由圖4a可知,培養基濃度在33～38.5 g/L,搖瓶培養時間在18～21 h時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖呈橢圓形,說明兩者之間交互影響顯著。由圖4b可知,靜止時間在84～90 h,培養基濃度在33～38.5 g/L時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4c可知,接種量在5%,培養基濃度在33～38.5 g/L時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖呈圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4d可知,搖瓶時間在18～21 h,靜止時間在84～90 h時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4e可知,接種量在5%,搖瓶時間在18～21 h時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4f可知,接種量在5%,靜止培養時間在84～90 h時,番茄紅素產量達到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。

2.2.2 最佳二階段發酵條件的確定和驗證 由Design Expert 8.0.6軟件分析得最佳二階段發酵條件為:培養基濃度34.57 g/L,搖瓶培養時間18.97 h,靜止培養時間87.09 h,接種量5.04%,其理論番茄紅素產量為19.97 mg/L。為了便于實際操作,將二階段發酵條件修正為:培養基濃度35 g/L,搖瓶培養時間19 h,靜止培養時間87 h,接種量5%,經三次重復試驗驗證后,得到番茄紅素產量為(19.87±0.28) mg/L,與預測值之間沒有顯著差異。

2.3 二階段培養法與搖瓶培養法對菌體干質量和番茄紅素產量的影響

二階段培養法采用上述最佳工藝發酵條件,搖瓶培養采用耿英龍等[7]研究的液態培養條件,從圖5可知,相對傳統搖床培養法,二階段培養法降低了菌體的質量,但提高了番茄紅素的產量。菌體干質量減少了23.54%,番茄紅素的產量提高了102.54%,可見二階段培養可以明顯提高番茄紅素的產量。

圖5 番茄紅素產量的響應面圖Fig.5 Response surface stereogram of lycopene production

圖6 二階段培養法與搖瓶培養法對菌體干質量和番茄紅素產量的影響Fig.6 Effects of two-stage culture and shake culture on dry cell weight and lycopene production

3 結論

利用響應面法建立了二階段培養粗糙脈胞菌產番茄紅素發酵工藝的二次項數學模型,通過方差分析模型顯著,方程擬合度良好。影響二階段培養粗糙脈胞菌發酵產番茄紅素的各因素主次順序為:靜止培養時間>搖瓶培養時間>培養基濃度>接種量。最佳發酵工藝條件為:培養基濃度35 g/L,搖瓶培養時間19 h,靜止培養時間87 h,接種量5%。在此條件下,相對傳統搖床培養法,菌體干質量減少了23.54%,番茄紅素的產量提高了102.54%。