蓮藕多酚-多糖復合脂質體的制備及穩定性評價

王詩琪,鐘照恬,易 陽,*,閔 婷,王麗梅

(1.武漢輕工大學食品科學與工程學院,湖北武漢 430023; 2.武漢輕工大學生物與制藥工程學院,湖北武漢 430023)

蓮藕是我國種植面積最大、產量最高的水生蔬菜,富含碳水化合物、蛋白質、維生素、礦物質等,且據古醫書記載連藕具有清熱止血、調節內分泌、滋陰安神等功效[1-2]。據現代藥理學研究可知,蓮藕及其提取物具有免疫調節、降血脂、降血壓、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等作用,而多酚和多糖是其主要的功能因子[3-6]。但是,關于蓮藕功能性產品的研究開發鮮見報道。

目前,關于植物功能性成分的提取開發主要包括:提取制備濃縮液、提取干制為粉劑、制成(復合)片劑或脂質體等。大量研究報道了蓮藕多酚和多糖的提取工藝[7-8],但極少涉及相關提取物的產品制備。脂質體作為一種生物降解性和生物相容性功能性成分載體,具備一定的靶向性和緩釋性,具有減少功能性成分用量、提高利用率、增強功能成分穩定性等優點,近年來受到廣泛的關注[9-11]。馬寧等[12]采用乙醇注入-超聲法制備茶多酚脂質體,提高茶多酚的穩定性和生物利用率,從而拓展其在食品及工業中的應用;Wu等[13]采用逆向蒸發法制備甘草多糖脂質體,增強了甘草多糖的免疫活性;而Fan等[14]制備淫羊藿多糖和蜂膠黃酮的復合脂質體,該脂質體相比于單一脂質體更穩定,且起到了協同增效的作用。當前,對蓮藕多糖和多酚的研究主要集中在提取、分離純化、結構/組成分析以及活性評價等方面[3-8],關于脂質體的開發尚未見報道。

本文分離純化蓮藕中多糖和多酚,采用逆向蒸發法制備其復合脂質體,以多糖和多酚的包封率為指標,結合單因素試驗和正交試驗優化其配方與工藝,然后進一步考察脂質體在不同貯藏形式和條件下的穩定性,以期為蓮藕功能成分的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蓮藕 武漢市金水祺良農副產品有限公司,鄂蓮5號;大豆卵磷脂 上海源葉生物科技有限公司,純度>90%;膽固醇 上海源葉生物科技有限公司,純度>95%;Triton X-100、沒食子酸和Folin-Ciocalteu試劑 分析純，國藥集團化學試劑有限公司;HPD-100大孔樹脂 上海摩速科學器材有限公司,分析純;HiPrepSephacryl S-100凝膠 美國GE Healthcare公司。

XHF-D型高速分散器 寧波新芝科技股份有限公司;UV-1800型紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司;RE-200A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;Nano-ZS90 型納米粒度和Zeta電位儀 英國馬爾文儀器有限公司;SB-5200型超聲清洗器 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蓮藕多酚和多糖的分離純化 參考徐燕燕[15]的方法提取蓮藕多酚,取新鮮蓮藕切碎至蓮藕渣,按料液比為1∶20 (g/mL)加入40%濃度乙醇,采用勻漿機以10000 r/min轉速處理5 min。勻漿由乙酸調節至pH3,置于200 W超聲場中持續浸提72 min,經4500 r/min離心10 min分離上清液。過濾上清液后得到多酚粗提液,60 ℃真空濃縮后,放置于-20 ℃冰柜保存。采用HPD-100型大孔樹脂靜態吸附純化多酚,得到多酚純度為58.21%,主要由沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素和兒茶素組成。

參考王瑜[16]的方法提取蓮藕多糖,取新鮮蓮藕切碎至蓮藕渣再稱取100 g加入1.5 L蒸餾水,采用高速勻漿機以8000 r/min轉速均質處理5 min,置于90 ℃熱水浴中浸提2 h。浸提結束后4500 r/min離心10 min分離上清液。并將上清液過濾后于65 ℃真空濃縮約至200 mL。濃縮液加入無水乙醇調節乙醇體積濃度至30%或40%,于4 ℃靜置6 h后離心(4500 r/min,10 min)除去沉淀,調節乙醇體積濃度至80%繼續靜置6 h沉淀無淀粉多糖。離心分離沉淀,采用80%乙醇洗滌后蒸發乙醇,用適量蒸餾水溶解并冷凍干燥得到蓮藕粗多糖。提取的多糖采用HiPrepSephacryl S-100凝膠過濾層析純化,得到多糖純度為51.31%,其結構為[α-D-Glc(1-4)-]n型葡聚糖。

1.2.2 蓮藕多酚-多糖復合脂質體的制備工藝 參考李唐棣[25]的方法并略做修改,采用逆向蒸發法制備脂質體。取一定量的磷脂與膽固醇作為膜材,以10 mL含有一定量蓮藕多酚的40%乙醇溶液溶解膜材,與30 mL含有一定量蓮藕多糖的磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L,pH=7.4)混合,40 kHz,300 W下超聲處理一定時間;于55 ℃真空旋轉濃縮,直至圓底燒瓶上形成均勻膠狀薄膜;加入磷酸鹽緩沖液旋轉使凝膠脫落,用高速分散器在一定轉速下剪切處理為均勻的脂質體混懸液。另在同樣的條件下制備不含蓮藕多酚和多糖的空白脂質體。

1.2.3 蓮藕多酚-多糖復合脂質體制備的單因素實驗 取多酚質量濃度15 mg/mL多糖質量濃度1.5 mg/mL、磷脂-膽固醇質量比4∶1、超聲處理時間6 min、高速剪切轉速8000 r/min為復合脂質體制備的基本工藝參數,分別變換多酚質量濃度5、10、15、20和25 mg/mL;多糖質量濃度1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 mg/mL;磷脂-膽固醇質量比1∶10、1∶8、1∶6、1∶4和1∶2;超聲處理時間3、6、9、12和15 min;高速剪切轉速4000、6000、8000、10000和12000 r/min,考察以上因素對蓮藕多酚-多糖復合脂質體包封率的影響。

1.2.4 正交試驗 在單因素實驗的基礎上,確定影響脂質體的包封率的主要因素為多酚質量濃度、多糖質量濃度及磷脂-膽固醇質量比,根據單因素實驗結果,固定超聲時間為6 min、高速剪切轉速為8000 r/min,設計L9(43)正交試驗優化蓮藕多酚-多糖復合脂質體制備的配方,因素及水平如表1所示。

表1 正交試驗因素及其水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 蓮藕多酚-多糖復合脂質體的試樣制備及穩定性評價 按優化配方和工藝參數制備蓮藕多酚-多糖復合脂質體,采用磷酸鹽緩沖液定容至原體積的1/4。取2.5 mL脂質體懸濁液至西林瓶中,經-20 ℃預凍 24 h后于-55 ℃冷凍干燥36 h得凍干脂質體復合物,密封保存用于穩定性評價。

將脂質體懸濁液分裝于9組西林瓶中,每組3瓶,每瓶2.5 mL。其中1組用于分析脂質體初始特征(多酚包封率、多糖包封率、Zeta電位和粒徑分布),另8組分別置于4 ℃和25 ℃條件下保存24、48、72和96 h后進行分析[17]。

取9組含凍干脂質體粉末的西林瓶(每組3瓶),其中1組每瓶加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液重建后分析凍干脂質體初始特征,另8組分別置于4 ℃和25 ℃條件下保存5、10、15和20 d后進行脂質體重建與分析[17]。

1.2.6 分析方法

1.2.6.1 多酚和多糖包封率的測定 采用Folin-Ciocalteu法測定多酚質量濃度[18],結果以沒食子酸當量表示。參考王文等[19]的方法,采用苯酚硫酸法檢測多糖含量,結果以葡萄糖當量表示。基于脂質體游離多酚(游離多糖)和總多酚(總多糖)的質量濃度按如下公式計算復合脂質體的包封率(EE):

包封率(EE,%)=(Ct- Cf)/Ct×100

式中:Ct為總酚(總多糖)濃度,mg/mL;Cf為游離多酚(多糖)濃度,mg/mL;EE為包封率,%。

1.2.6.2 粒徑和Zeta電位分布測定 取復合脂質體樣品稀釋適當的倍數,加入樣品池中,用Nano-ZS90 型納米粒度和Zeta電位儀測定其粒徑分布和Zeta電位[20]。

1.3 數據處理

實驗數據均以 “平均值±標準偏差”表示(n=3)。采用SPSS 19.0軟件S-N-K檢驗分析組間數據顯著性差異(0.05水平)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 多酚質量濃度對脂質體包封效果的影響 由圖1可知,隨著蓮藕多酚質量濃度的增加,脂質體的多酚包封率先增后減,各組間差異顯著(P<0.05),在多酚質量濃度15 mg/mL時獲得最大多酚包封率70.27%,此時多酚的包封可能達到飽和。而多糖包封率則隨蓮藕多酚質量濃度的增加顯著降低(P<0.05),直至多酚質量濃度超過15 mg/mL后趨于穩定(P>0.05),這一結果與曠英姿的研究相似[21]。為了獲得相對高的多酚包封率,選擇蓮藕多酚添加質量濃度為10～20 mg/mL。

圖1 蓮藕多酚質量濃度對脂質體包封效果的影響Fig.1 Effect of lotus root polyphenol content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.2 多糖質量濃度對脂質體包封效果的影響 由圖2可知,當多糖質量濃度由1.0 mg/mL增加至1.5 mg/mL,多糖包封率和多酚包封率均未發生顯著變化(P>0.05),但隨后呈現截然不同的變化趨勢:多糖包封率顯著增加(P<0.05),繼而維持穩定(P>0.05),這一現象與趙永新的研究結果基本一致[22];多酚包封率顯著下降(P<0.05),后在多糖質量濃度2.0～2.5 mg/mL之間維持穩定水平(P>0.05),而在多糖質量濃度3.0 mg/mL時，多酚包封率最低(25.10%),這可能與多糖與多酚的非共價相互作用機制有關[23],多酚與多糖通過非共價作用形成聚合物增大了顆粒直徑,導致多酚的包封率下降。為了獲得相對較高的多糖包封率,選擇蓮藕多糖添加質量濃度為1.5 mg/mL。

圖2 蓮藕多糖質量濃度對脂質體包封效果的影響Fig.2 Effect of lotus root polysaccharide content on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.3 磷脂-膽固醇質量比對脂質體包封效果的影響 磷脂-膽固醇質量比對脂質體包封效果的影響如圖3所示。蓮藕多糖和多酚的包封率均呈先上升后下降的趨勢,且二者均在磷脂-膽固醇質量比為1∶4時達最大值(P<0.05),分別為15.12%和77.61%。在茶多酚脂質體制備的研究中優化的最佳配方中磷脂-膽固醇比為3∶1[24],而本實驗中添加了大量多糖成分,增強了其水溶性,則需要提高膽固醇的量以提高包封率[25]。膽固醇是脂質體類脂膜的重要組成部分,添加適量的膽固醇可以增加脂質雙分子膜中脂質分子排列的緊密程度,調節磷脂分子膜的流動性,有助于減輕加熱時脂質分子烴基的彎曲程度,從而起到穩定脂膜和減少滲漏作用。但膽固醇增加過多可能增加脂質雙分子膜不對稱性,因而更易導致膜的不穩定,使包封內容物滲漏[26-27],為獲得較高的脂質體包封率,選擇磷脂-膽固醇質量比為1∶4。

圖3 磷脂-膽固醇質量比對脂質體包封效果的影響Fig.3 Effect of phospholipid-cholesterol mass ratio on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.4 超聲處理時間對脂質體包封效果的影響 由圖4可見,隨著超聲處理時間的延長,蓮藕多糖和多酚的包封率均呈先升后降的趨勢,且二者均在超聲處理6 min時達到最大包封率(P<0.05),分別為14.83%和70.12%。隨著超聲時間的延長,復合脂質體的粒徑和分散系數可以不同程度地減小,有助于提高包封率,但超聲時間過長時,脂質體磷的雙分子層被破壞,導致脂質體破裂[28]。故而,超聲處理時間以6 min為宜。

圖4 超聲處理時間對脂質體包封效果的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment time on the encapsulation efficiency of liposomes

2.1.5 高速剪切轉速對脂質體包封效果的影響 由圖5可知,蓮藕多糖和多酚的包封率均隨著高速剪切轉速的增加先增后減,二者均在8000 r/min時獲得最大包封率(P<0.05),分別為16.24%和77.09%。增加剪切轉速有助于形成狀態穩定、大小較均一的脂質體混懸液,但是轉速過大容易引起復合脂質體膜破裂,包封內容物泄漏[26-27]。故脂質體混懸液高速剪切轉速選擇8000 r/min為宜。

圖5 高速剪切轉速對脂質體包封效果的影響Fig.5 Effect of rotational speed on the encapsulation efficiency of liposomes

2.2 蓮藕多酚-多糖復合脂質體的配方優化

通過正交設計確定復合脂質體配方。在前期實驗基礎上確定了影響復合脂質體包封率的主要因素:蓮藕多酚質量濃度、蓮藕多糖質量濃度和磷脂-膽固醇質量比。因此設計L9(43)正交試驗,結果見表2。

表2 復合脂質體配方優化正交試驗設計與結果Table 2 The orthogonal experiment design and results of formulation optimization for the liposome complex

由表2極差分析和表3方差分析可知,各因素對蓮藕多酚包封率和多糖包封率的影響均依次為:磷脂-膽固醇質量比(C)>多酚質量濃度(A)>多糖質量濃度(B),僅磷脂-膽固醇質量比(C)及多酚質量濃度(A)對蓮藕多酚包封率有顯著影響(P<0.05)。包封蓮藕多酚的最優組為A2B2C2,包封蓮藕多糖的最優組為A2B3C2,因為多糖質量濃度對多酚和多糖包封率均無顯著影響(P>0.05),為減少多糖添加量,確定復合脂質體制備的最優配方為A2B2C2即:蓮藕多酚質量濃度15 mg/mL,蓮藕多糖質量濃度1.5 mg/mL,磷脂-膽固醇質量比1∶4。進一步驗證發現,在該條件下所得脂質體的多酚包封率為72.36%±2.83%,多糖包封率為15.66%±1.01%,電位為-(38.70±0.39) mV,粒徑為(123.01±0.97) nm。

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

2.3 蓮藕多酚-多糖復合脂質體的穩定性

2.3.1 貯藏過程中脂質體的多酚和多糖包封率變化 包封率是判斷脂質體穩定性的主要指標之一,隨著貯藏時間的增加,4和25 ℃貯藏液態復合脂質體和凍干脂質體的多酚包封率在不同階段均發生顯著下降(P<0.05)。如圖6(Ⅰ)所示,在4 ℃貯藏96 h后液態脂質體多酚包封率由72.36%降至49.28%,而25 ℃下則降至25.09%,包封率降幅分別為23.08%和47.27%;如圖6(Ⅱ)所示,凍干脂質體在4 ℃貯藏20 d后多酚包封率由72.66%降至65.13%,而25 ℃下則降至57.66%,包封率降幅分別為7.53%和15.00%。兩種脂質體在相同貯藏時間下(貯藏24 h后),4 ℃的多酚包封率均顯著高于25 ℃,說明低溫有利于脂質體的貯藏,與楊培民[20]中使用的低溫貯藏的方式制備的白花蛇舌草黃酮苷元脂質體的穩定性高于高溫實驗下的脂質體這一研究結果一致。同時,相比于液態脂質體,凍干脂質體在相同條件下儲藏相同時間其多酚包封率下降幅度明顯減小,說明凍干脂質體更有利于長期儲藏,這可能與凍干脂質體水分少,易氧化成分更加穩定有關[29]。

圖6 蓮藕多酚-多糖復合脂質體貯藏過程中的多酚包封率變化Fig.6 Changes of encapsulation efficiency of polyphenols during storage of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes注:圖Ⅰ為液態脂質體,圖Ⅱ為凍干脂質體; 不同小寫字母表示在4 ℃溫度下,不同貯藏時間 脂質體的多酚包封率的差異顯著P<0.05;不同大寫 字母表示在25 ℃溫度下,不同貯藏時間脂質體的 多酚包封率的差異顯著P<0.05;圖7～圖9同。

不同貯藏溫度下,時間對液態復合脂質體多糖包封率和凍干脂質體多糖包封率的影響,如圖7所示。隨著貯藏時間的延長,4 ℃和25 ℃貯藏液態復合脂質體和凍干脂質體的多糖包封率在不同階段均顯著下降(P<0.05),如圖7(Ⅰ)所示。4 ℃貯藏96 h后多糖包封率由15.67%降至6.81%,而25 ℃下則降至6.23%,包封率降幅分別為8.86%和9.44%;凍干脂質體在4 ℃貯藏20 d后多糖包封率由15.55%降至11%,而25 ℃下則降至9.45%,包封率降幅分別為4.55%和6.1%。兩種脂質體在相同貯藏時間下(貯藏24 h后),4 ℃的多糖包封率均高于25 ℃,說明低溫有利于脂質體的貯藏,高金芝等[30]將人參皂苷Re凍干脂質體置于4 ℃下貯藏10 d,發現各指標無明顯變化,而40 ℃及60 ℃下各指標穩定性較差。同時,相比于液態脂質體,凍干脂質體在相同條件下儲藏相同時間其多糖包封率下降幅度明顯減小,這一現象與Strauss[31]的研究相符。

圖7 蓮藕多酚-多糖復合脂質體貯藏過程中的多糖包封率變化Fig.7 Changes of polysaccharide encapsulation rate of lotus root polyphenol-polysaccharide complex liposomes during storage

2.3.2 貯藏過程中脂質體的電位變化 脂質體在溶液中的運動與荷電膠體粒子相似,通過改變組分的荷電性質和荷電量及介質的離子強度,可以使電位保持在足夠高的水平,并減少顆粒相互間的聚沉和融合,增加穩定性[22]。隨著貯藏時間的延長,4 ℃和25 ℃貯藏液態復合脂質體電位和凍干脂質體電位的絕對值在不同階段均顯著下降(P<0.05),如圖8所示。液態脂質體在4 ℃貯藏96 h后復合脂質體電位的絕對值由38.70降至26.97,而25 ℃下則降至25.40,復合脂質體電位的絕對值降幅分別為11.73和13.30;凍干脂質體在4 ℃貯藏20 d后復合脂質體電位的絕對值由38.70降至35.80,而25 ℃下則降至28.97,復合脂質體電位的絕對值降幅分別為2.90和9.73。相同貯藏時間下(貯藏24 h后),4 ℃的復合脂質體電位的絕對值顯著均高于25 ℃,說明低溫有利于脂質體的貯藏。同時,相比于液態脂質體,凍干脂質體在相同條件下儲藏相同時間其脂質體電位下降幅度明顯減小。

圖8 蓮藕多酚-多糖復合脂質體貯藏過程中脂質體的電位變化Fig.8 Changes of potential of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

2.3.3 貯藏過程中脂質體的粒徑變化 脂質體的大小直接影響包埋物質的載量、釋放、利用率以及生物體內分布和靶向性,控制粒子的大小和獲得較窄且均勻的粒度分布是制備納米制劑的關鍵[25]。隨著貯藏時間的增加,4 ℃和25 ℃貯藏液態復合脂質體的粒徑與凍干脂質體的粒徑在不同階段均發生顯著增加(P<0.05),如圖9所示。液態脂質體在4 ℃貯藏96 h后復合脂質體的粒徑由123.10 nm增加至151.17 nm,而25 ℃下則增至157.63 nm,復合脂質體的粒徑增加了22.80%和28.05%;凍干脂質體在4 ℃貯藏20 d后復合脂質體的粒徑由123.10 nm增加至128.47 nm,而25 ℃下則增至135.37 nm,復合脂質體的粒徑增加了4.36%和9.97%相同貯藏時間下(貯藏24 h后)。4 ℃的復合脂質體的粒徑均小于25 ℃。實驗結果表明脂質體儲藏時會隨著時間的延長造成凝聚沉淀,而在冷藏條件下可延緩此變化,與參考文獻中低溫貯藏可以減緩白花蛇舌草脂質體復合物的粒子沉降速度這一研究結果一致[20]。同時,相比于液態脂質體,凍干脂質體在相同條件下儲藏相同時間其脂質體粒徑增大幅度明顯減小,這一結果與Cavalli R的研究相符合[32]。

圖9 蓮藕多酚-多糖復合脂質體貯藏過程中脂質體的粒徑變化Fig.9 Changes of particle size of lotus root polyphenol- polysaccharide complex liposome during storage

3 結論

采用逆向蒸發法制備蓮藕多糖-多酚復合脂質體,得出蓮藕多糖-多酚復合脂質體最佳制備工藝為:磷脂-膽固醇質量比為1∶4、蓮藕多酚質量濃度為15 mg/mL、蓮藕多糖質量濃度為1.5 mg/mL、超聲時間6 min、高速剪切轉速為8000 r/min。在該工藝條件下所得脂質體的電位為-38.70 mV、粒徑為123.01 nm、蓮藕多酚包封率為72.36%、多糖包封率為15.66%。同時考察不同貯藏條件對蓮藕多糖-多酚復合脂質體穩定性的影響,結果發現凍干脂質體的穩定性明顯優于液態脂質4 ℃,而低溫(4 ℃)有利于脂質體保存。在4 ℃下,凍干脂質體貯藏20 d與液體脂質體放置24 h的包封率相近,蓮藕多酚包封率約65%、多糖包封率約11%,綜上所述,相比單一脂質體,凍干的蓮藕多酚-多糖復合脂質體具有更高的穩定性和生物利用率,該實驗結果為蓮藕功能產品的進一步開發提供了一定的參考。