木薯水解液為原料靜置發酵制備細菌纖維素的研究

張沙沙,蔡 威,吳冬陽,崔 斌,沙如意,毛建衛

(浙江科技學院生物與化學工程學院,浙江省農產品化學與生物 加工技術重點實驗室,浙江省農業生物資源生化制造協同中心,浙江杭州 310023)

細菌纖維素(Bacteriacellulose,BC)是由醋酸菌屬(Acetobacter)、根瘤菌屬(Rhizobium)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)和八疊球菌屬(Sarcina)中的一些特殊微生物所產生的纖維素。目前,已有大量利用葡萄糖酸醋桿菌屬菌種生產細菌纖維素的研究報道,目前極少有從葡萄糖酸醋桿菌屬中分離出來并被命名為Komagataeibacter屬菌種生產細菌纖維素的研究報道。研究利用Komagataeibacter屬菌種(如Komagataeibacterxylinus)生產細菌纖維素,可以為細菌纖維素的發酵生產提供更廣泛的菌種資源。

相比于其他纖維素,細菌纖維素是一種“純”纖維素,具有優良的特性,例如高結晶度、高純度、高持水性等[2]。BC具有廣泛應用,在食品行業中,BC被稱為椰果(Nata),常用于乳制品和飲料中,具有熱量低、口感好、不易被人體消化等特征,可以促進腸道蠕動達到減肥的效果,預防肥胖并發癥[3],同時可在肉腸中代替肉類以減少產品的熱量[4]。在醫藥行業中BC具有改善人體消化環境、減少便秘、降低膽固醇、預防癌癥等作用,還可以用作醫藥輔料、人工角膜和人工血管等[5]。在紡織行業中,由于細菌纖維素結構與植物纖維素結構相似,因此細菌纖維素可作為人造纖維材料用于制作衣物等[6]。細菌纖維素在其它領域上的應用也正在研究開發中。

目前BC的發酵碳源大多為葡萄糖,生產成本高,極大限制了細菌纖維素的生產規模。以水果、廢棄纖維素、低值淀粉等農副加工副產物為主,通過發酵生產BC為突破口,可以為細菌纖維素的發酵尋找新的研究方向[7]。木薯是一種來源廣泛且價格低廉的原料,其主要成分為淀粉,在鮮木薯中淀粉含量大概為25%～30%。因而,木薯是一種較實惠的農作物,相比于葡萄糖而言,更適合用于生產大量細菌纖維素所需要的能源物質。但是,木薯中含有一些其他的營養物質,例如蛋白質、微量元素等,這些物質可能會促進或者抑制細菌產纖維素能力,具體情況還需要進一步的實驗驗證。本研究主要以木薯全粉為原料,經過預處理、酶解、發酵等制備BC,對影響細菌纖維素產量的影響因素進行研究,同時研究發酵過程中BC的產量與還原糖消耗以及pH的關系,并對BC的結構性質進行分析,旨在為BC的生產提供新的數據支撐[8]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Komagataeibacterxylinus實驗室紅茶菌中分離,并保藏于Genebank數據庫(GenBank accession number MK386709);氫氧化鈉、冰醋酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母浸粉 北京奧博星生物技術有限責任公司;葡萄糖 江蘇強盛功能化學股份有限公司;無水乙醇 上海凌峰化學試劑有限公司;干燥木薯粉 廣西玉林市木薯基地;液化酶、糖化酶(酶活力(U/g)≥100000.0) 杰能科(中國)生物工程有限公司;硫酸鎂、磷酸氫二鉀、纖維素酶(酶活力(U/g)≥15000.0) 國藥集團化學試劑有限公司。

GZX-9140MBE電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SPX-250B-Z恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司;JEM-1011透射電鏡 日本電子公司;PHS-3CPH計 杭州齊威儀器有限公司;FA2004電子天平 上海舜宇橫平科學儀器有限公司;傅立葉變換紅外光譜儀 德國布魯克儀器公司;KQ-500E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Q500-V20.6熱重分析儀 美國TA儀器;D8ADVANCE型X射線衍射儀 日本島津公司;VARIO MICRO元素分析儀 瑞士大昌華嘉集團公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 木薯水解液制備 稱取一定量的木薯粉,烘至恒重,放入燒杯中,木薯粉∶水為1∶30,調pH為6,常溫超聲30 min;加入1%液化酶95 ℃水浴3 h。反應結束后用HCl調pH為4.0;向液化水解液中加入1%糖化酶和1%纖維素酶,將反應器放入65 ℃恒溫水浴鍋中,反應72 h。反應完畢后利用NaOH溶液中和水解液至pH=7,抽濾得到濾液后減壓蒸餾,用DNS法測定濃縮液的還原糖含量[9]。處理后放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 培養基配制 種子培養基:葡萄糖1 g,酵母膏1 g,乙醇3.5 mL,pH6,水100 mL。

菌種活化培養基:酵母粉1 g,水100 mL,葡萄糖2 g,蛋白胨1 g。

發酵培養基:酵母粉1 g,乙醇3.5 mL,水100 mL,pH6,木薯水解液若干,MgSO41 g,K2HPO40.1 g。

1.2.3 BC的發酵Komagataeibacterxylinus菌種活化:從-80 ℃冰箱中取出一支菌種置于已滅菌的Komagataeibacterxylinus菌種活化培養基中,30 ℃,160 r/min,搖床培養48 h。將已活化好的菌種按一定的接種量加入已滅菌的發酵培養基中。30 ℃培養箱靜置培養,測定發酵過程中BC產量、還原糖含量和pH。

1.2.4 木薯水解液發酵生產BC單因素實驗 控制不同的初始pH、木薯水解液添加量、裝液量、接種量、溫度5個因素,研究其對BC產量的影響。

1.2.4.1 溫度對BC產量的影響 將菌種接入到已滅菌好的100 mL含有5%木薯水解液的發酵培養基(初始pH6.0)中,分別放入20、25、30、35、40、45 ℃培養箱培養7 d,測定BC產量。

1.2.4.2 裝液量對BC產量的影響 選擇50、75、100、125、150 mL已配制好且滅菌過的5%木薯水解液發酵培養基加入到250 mL錐形瓶中,接入5%菌種,初始pH6.0,溫度30 ℃,培養7 d,測定BC產量。

1.2.4.3 初始pH對BC產量的影響 調節含有5%木薯水解液發酵培養基(裝液量75 mL)的初始pH分別為4、5、6、7、8這5個梯度,接入5%菌種,溫度30 ℃,培養7 d,測定BC產量。

1.2.4.4 木薯水解液添加量對BC產量的影響 選擇1%、2%、3%、4%、5%、6%添加量的木薯水解液于75 mL發酵培養基中,接入5%菌種,初始pH6,溫度30 ℃,培養7 d,測定BC產量。

1.2.4.5 接種量對BC產量的影響 選擇3%、6%、9%、12%、15%已活化好的菌種接入已配制好且滅菌過的75 mL含有5%木薯水解液發酵培養基中,初始pH6,溫度30 ℃,培養7 d,測定BC產量。

1.2.5 分析方法

1.2.5.1 還原糖含量的測定 分別取葡萄糖標準液(1 mg/mL)0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL于15 mL試管中,用蒸餾水補足至1.0 mL,分別準確加入DNS試劑1.5 mL,沸水浴加熱5 min,冰水浴冷卻,用水補足到10 mL,在540 nm波長下測定吸光度,制作還原糖標準曲線。以還原糖含量x(mg/mL)為橫坐標,以吸光度y為縱坐標,得到葡萄糖標準曲線,y=1.623x-0.1333,相關系數R2=0.9993。利用DNS試劑測定發酵液中的還原糖含量(g/L)。

1.2.5.2 BC產量的測定 對發酵培養基利用濾紙過濾,將得到的白色凝膠狀薄膜產物浸入0.1%的NaOH溶液中煮沸30 min,以洗去其表面殘留的菌種,再用去離子水洗去產物表面殘留的NaOH溶液,最后再用稀醋酸溶液調pH為中性,65 ℃烘干至恒重,稱量得到干重(g),將干重除以相應的裝液量得到BC產量(g/L)。

1.2.5.3 pH測定 取5 mL體積的發酵液,利用pH計測定pH。

1.2.6 細菌纖維素的理化表征

1.2.6.1 細菌纖維素含水率的測定 將處理好的細菌纖維膜,拭干膜表面水分后,稱重記錄為M濕1(g)。然后再將膜放入65 ℃的鼓風干燥箱中至恒重[10],記錄重量為M干。

含水率(W1,%)的計算公式如下:

1.2.6.2 細菌纖維素復水率的測定 將已經干燥好的細菌纖維素放入水中24 h,使其充分吸收水分,拭干膜表面的水分后,電子天平稱重[10],記錄為M濕2。

復水率(W2,%)計算公式如下:

1.2.6.3 元素分析 取細菌纖維素樣品研磨成粉末狀,并準確稱量18～22 mg于錫箔紙中,抽真空干燥后進行C、H、O、N、S的元素分析,計算各元素的含量。

1.2.6.4 紅外光譜分析 采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR),將細菌纖維素充分干燥后粉碎,與干燥的KBr粉末充分研磨混合、壓片;利用分辨率為4 cm-1,掃描波長范圍為400～4000 cm-1進行分析[10]。

1.2.6.5 熱重(TGA)分析 將細菌纖維素在鼓風干燥箱中充分干燥至恒重后,磨碎,稱量10 mg左右于Al2O3小坩堝中,放入熱重分析儀中在空氣氣氛下檢測[3]。升溫速度:10 ℃/min;溫度范圍:50～900 ℃;保護氣(空氣):150 mL/min。

1.2.6.6 掃描電鏡觀察 將干燥好的細菌纖維素樣品剪成直徑為0.1 cm左右的小碎片,再將小碎片置于真空鍍膜機中對其表面噴金15 s,噴金后的樣品于掃描電鏡中5 kV電壓下觀察其結構[3]。

1.2.6.7 X-射線衍射分析 將細菌纖維素充分干燥后,磨碎,取適量的粉末于樣品板上。Cu靶,10 kV高壓,管流為50 mA,2θ=5～50 °掃描,得到XRD光譜[11]。

1.3 數據處理

實驗組重復數n=3,采用Origin 8.5繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 木薯水解液生產細菌纖維素單因素探究

木薯水解液經過預處理、酶解等一系列過程,可以作為培養生產細菌纖維素的優質碳源。細菌纖維素在生產期間受到很多環境因素的影響,首先考察培養基的初始pH、溫度、接種量、裝液量、木薯水解液添加量等對細菌纖維素生產的影響。

2.1.1 溫度對BC產量的影響 如圖1所示,隨著溫度的上升,細菌纖維素呈先增加后下降的趨勢,在30 ℃時產量達最高值,40 ℃后將不再生產細菌纖維素,因此,細菌纖維素的最適生產溫度為30 ℃,這與陳慧慧等[20]的研究結果相一致。

圖1 溫度對細菌纖維素產量的影響Fig.1 Effect of temperature on bacterial cellulose production

2.1.2 裝液量對BC產量的影響 由圖2可知,裝液量在75 mL時,細菌纖維素的產量最高,綜合考慮,其原因是50 mL裝液量的總營養物質在發酵過程中被快速消耗完畢導致后期的生產基本停止,75 mL之后隨著裝液量的增加細菌纖維素的產量下降主要是由于細菌纖維素的生長需要耗氧,培養液體表面積比越大其本身的溶氧量越小,不利于醋酸菌生產細菌纖維素。最優裝液量在75 mL,這與周艷等[19]的研究相同。

圖2 裝液量對細菌纖維素產量的影響Fig.2 Effect of fermentationbroth volume on bacterial cellulose production

2.1.3 初始pH對BC產量的影響 從圖3中明顯得出，在初始pH為6時所得的BC產量最高,BC產量從初始pH為4時隨著pH上升而上升,初始pH6以后隨著pH的增大而減小,可能是醋酸菌的生長需要微酸性環境且由于自身的生長產生大量的醋酸迫使環境pH下降,過低的pH又會抑制醋酸菌的生命活動,因此在低的初始pH反而不利于細菌纖維素的生長,反之,過高的初始pH也不利于醋酸菌的生長。產細菌纖維素菌種,如木醋桿菌適應于酸性環境生長,但過酸的環境不利于其生長發育從而抑制了細菌纖維素的產生,故最適初始pH在6,這與仲華維等的研究相同[17]。

圖3 初始pH對細菌纖維素產量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on bacterial cellulose production

2.1.4 木薯水解液添加量對BC產量的影響 如圖4所示,在5%的木薯水解液添加量下得到的細菌纖維素產量是最高的,隨著木薯水解液的添加量的繼續上升，細菌纖維素的產量反而下降,主要是因為醋酸菌能夠代謝碳源產生乙酸,使發酵培養基的pH下降,抑制了BC的合成,由圖可得此種醋酸菌適合在5%的木薯水解液下生產細菌纖維素,較高的水解液不利于BC的生產。細菌纖維素產量隨著還原糖濃度的增加呈現先增加后減少的趨勢,這是因為還原糖作為細菌生命活動中不可或缺的能源和營養物質,被微生物快速的用于菌體生長進而促進纖維素的生產,但還原糖濃度的增加也會促進酸的生產,過量酸反而抑制了菌體的生長從而限制了細菌纖維素的合成,本實驗最適木薯水解糖液濃度為5%,相當于3%葡萄糖量。

圖4 木薯水解液添加量對細菌纖維素產量的影響Fig.4 Effect of cassava hydrolysate addition on bacterial cellulose production

2.1.5 接種量對BC產量的影響 如圖5所示,隨著接種量的增加,BC產量也在隨之增加,但在6%以后的上升較平穩。接種量的大小會影響木醋桿菌的生長、繁殖、代謝的速度,接種量過大,會使得底物在前期過快消耗,不利于后期代謝產物積累;接種量過小,會延長發酵時間,對細菌纖維素的產生帶來不利影響,最優菌種添加量為6%,這與杜倩雯等[18]的研究結果相一致。

圖5 接種量對細菌纖維素產量的影響Fig.5 Effect of inoculum size on bacterial cellulose production

2.2 細菌纖維素發酵動力學研究

如圖6所示,發酵過程中隨著發酵天數的增加培養液中還原糖含量和pH呈現降低的趨勢。相反隨著發酵天數的增加BC的產量呈現上升的趨勢,在第4～8 d的生長速率最快。在第1～3 d的時候pH下降最快,主要是由于前三天菌種處于增值階段,在其生長分裂過程中消耗還原糖產生酸導致pH快速下降;在第1、2、3 d主要是細菌的增殖階段,4、5、6、7、8 d有一個較高的轉化率,發酵生產過程中可以利用增加這一階段的時間從而達到增加產量的目的,在第8 d以后轉化率漸漸下降,主要是因為培養液中還原糖的大量消耗,在發酵過程中,可以在第8 d通過加糖液可以維持生產BC。

圖6 細菌纖維素發酵培養動力學Fig.6 Dynamics of bacterial cellulose production

2.3 木薯水解液生產細菌纖維素發酵過程中含水率與復水率變化

如圖7所示,木薯水解液生產細菌纖維素含水率96%～98%,復水率50%～58%。利用以上單因素實驗優化后的發酵培養基培養細菌纖維素,在第9 d時的BC產量為5.75 g/L。隨著BC產量的上升含水率和復水率也在逐漸增大,主要是由于其內部的網狀結構對水分子的鎖水能力的加強。

圖7 細菌纖維素的含水率與復水率Fig.7 Moisture content and rehydration rate of bacterial cellulose

2.4 細菌纖維素的理化表征

2.4.1 元素分析結果 如表1,木薯水解液原料發酵生產所得的細菌纖維素主要由C、H、O三種元素構成,這三種元素占總質量的98%以上。且C、H、O元素基本符合分子式(C6H10O5)n。

表1 元素分析結果Table 1 Elemental analysis results

2.4.2 紅外分析 如圖8,木薯水解液為碳源發酵生產的細菌纖維素,在1070 cm-1處為C-O鍵的伸縮振動,是纖維素的特征峰;在1566 cm-1為C-H鍵的伸縮振動;在2929 cm-1為CH2-CH伸縮振動;在3358 cm-1處為分子間氫鍵引起的O-H基的伸縮振動;這與陳慧慧等[12]的結果一致。通過紅外分析得到了具有纖維素所特有的特征峰,說明其含有與纖維素相同的基團,這與Chandrasekaran等[21]所得細菌纖維素圖譜基本相同。

圖8 紅外光譜分析Fig.8 Infrared spectrum analysis

2.4.3 熱重分析 如圖9,以木薯水解液發酵得到的細菌纖維素的Mass曲線和DTG曲線可以明顯的看出,在0～170 ℃范圍內質量有一個緩慢下降的趨勢,這主要是因為細菌纖維素含有一定的水分引起的;在170～320 ℃內細菌纖維素在分解過程中進行了各種物理化學反應,在分解過程中放了大量的熱,所以質量出現了急劇下降,失重32.33%;最快分解溫度在290 ℃左右;在320～500 ℃也出現了較大的失重,質量減少了19.58%,是由于細菌纖維素到達了煅燒階段;最快分解溫度在470 ℃左右。在500～900 ℃后曲線緩慢失重,剩余20%左右是灰燼。這與杜倩雯等[13]的研究結果相一致。從細菌纖維素的DTC曲線可以看出在處理階段溫度不能超過170 ℃,這與Costa等[22]的研究結果相一致。

圖9 Mass-DTG圖譜曲線Fig.9 Spectrum curve

2.4.4 掃描電鏡結果 如圖10,由掃描顯微鏡可以看出,利用木薯水解液所培養得出的細菌纖維素微管束直徑不到200 nm,屬于納米級的纖維素,而棉花的纖維素的直徑在10～100 μm,人造纖維的最小直徑在1 μm左右,通過掃描電鏡可以看出細菌纖維素表面有很多小孔,這是細菌纖維素膜有較高的持水性與復水性的原因。這與任澤祺等[14]的研究結果基本一致。

圖10 掃描電鏡圖譜分析Fig.10 Scanning electron microscope analysis

圖11 XRD晶體衍射Fig.11 XRD crystal diffraction

3 結論

利用單因素實驗確定以木薯水解液發酵生產細菌纖維素的最優條件為:溫度30 ℃、裝液量75 mL、初始pH6.0、木薯水解液添加量3%、接種量6%;在細菌纖維素發酵過程中,所得的細菌纖維素含水率為96%～98%,復水率為50%～58%,具有高的絡合水能力。元素分析表明細菌纖維素主要有C、H、O三種元素組成,紅外光譜分析驗證了細菌纖維素的特征吸收峰。差熱分析表明細菌纖維素的最大失重溫度為290 ℃,熱穩定性較好,表明這種細菌纖維素在一些耐高溫材料中有很重要的應用價值。掃描電鏡結果表明細菌纖維素是一種網狀納米結構,是由高密度的纖維絲相互纏繞而成,并具有較大的網格,可以通過技術手段將藥品絡合在細菌纖維素網狀結構中,將其應用在醫用輔料中。XRD晶體衍射進一步表明制備的細菌纖維素有高的結晶度,可用作穩定的高分子材料。