響應面法優化日本黃姑魚魚肉免疫活性肽的提取工藝

胡旭陽,李 維,孔祥東,韓行標,唐云平,余方苗,楊最素,丁國芳

(浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江省海洋生物醫用制品工程技術研究中心,浙江舟山 316022)

海洋活性肽因具有免疫調節、舒張血管、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗炎及抗真菌等生理活性,成為目前海洋性功能成分的研究重點之一[1]。酶解法是提取制備海洋活性肽的一種常用方法,利用酶解法提取制備海洋活性肽已成為近年來的研究熱點[2]。Tang等[3]用酶解法提取了日本黃姑魚皮膠原蛋白,發現其有保濕活性,可用于化妝品行業。葉盛旺等[4]通過胃蛋白酶從青蛤中制備多肽,驗證其在體外的免疫調節作用。Vo等[5]從螺旋藻中用酶解法提取并純化了抗炎多肽。Wang等[6]從牡蠣中提取寡肽,作用于小鼠,發現有顯著的免疫作用。Ahn等[7]以鮭魚胸鰭副產物為原料,用胃蛋白酶酶解制備了抗炎多肽。Hou等[8]從鱈魚骨架中用胰蛋白酶提取了具有免疫活性的多肽。

日本黃姑魚(Nibeajaponica),俗稱黑毛鲿,隸屬鱸形目、石首魚科、黃姑魚屬,主要分布于中國東海及日本南部海[9]。日本黃姑魚味道鮮美,營養豐富,其鰾是名貴的中藥補品[10-11],魚皮中含有較高的膠原蛋白[12]。其魚肉蛋白質含量較高,易被人體消化吸收,但作為蛋白來源用于提取制備免疫活性肽的研究鮮為報道。

本論文利用5種商業化蛋白酶對日本黃姑魚肉進行酶解,以日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的相對增殖率為指標,篩選出最佳酶種,再經單因素實驗和響應面試驗確定該酶的最佳酶解條件,以期為日本黃姑魚肉免疫活性肽的制備及進一步研究其免疫調節作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

日本黃姑魚 浙江省海洋水產研究所提供;小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7 中科院上海細胞所,由本實驗室傳代培養;胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶 北京亞太恒信生物科技有限公司;DMEM培養基 Gibco公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO) Sigma公司;其余試劑 均為國產分析純。

JJ-2組織攪碎機 上海比朗儀器有限公司;DK-S24水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;CKX41倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司;CF16RXⅡ型高速低溫離心機 日本日立公司;ZHJH-C1209C型超凈工作臺 上海智誠分析儀器制造公司;Forma3111 CO2培養箱 美國Thermo公司;WRO-70型超純水儀 美國Millipore公司;酶標儀 美國Bio-Rad公司;BSA124S型電子天平 德國SatoriusAG公司;ALPHA 1-4/LDplus型冷凍干燥機 德國CHRIST公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 日本黃姑魚肉多肽工藝 日本黃姑魚肉經過預處理后,按一定的料液比加入純水,調節pH和酶解溫度,加入一定量的蛋白酶進行酶解。酶解完成后,滅酶活,待酶解液冷卻至室溫,調節酶解液的pH至中性。將酶解液離心取上清,冷凍干燥,凍干粉末即為日本黃姑魚肉多肽。

1.2.2 日本黃姑魚肉預處理 參考丁浩宸等[13]脫脂方法,取一定量的日本黃姑魚,去除魚皮、魚鰭和內臟等器官,清洗干凈。用絞碎機絞碎。絞碎的日本黃姑魚肉用95%乙醇,在料液比為1∶6 (m/v)、脫脂溫度為50 ℃的條件下,脫脂2次,每次1 h。將脫脂后的日本黃姑魚肉在4 ℃、12000 r/min預冷的離心機離心15 min,收集沉淀。用純水將沉淀洗至無乙醇味,凍干后放入-20 ℃冷凍備用。

1.2.3 最佳酶種的篩選 稱量5份10.0 g預處理過的日本黃姑魚肉,酶解方法參考文獻[14-16]進行實驗,以料液比1∶10 (g/mL)加入純水,每種蛋白酶的酶添加量為1500 U/g,混勻后分別在每種蛋白酶推薦的最適宜溫度和pH條件下(木瓜蛋白酶酶解條件為60 ℃、pH6.0;胰蛋白酶酶解條件為37 ℃、pH8.0;中性蛋白酶酶解條件為45 ℃、pH7.0;堿性蛋白酶酶解條件為45 ℃、pH10.0;胃蛋白酶酶解條件為37 ℃、pH2.0),酶解6 h,酶解完成后在沸水中滅酶活10 min,冷卻至室溫12000 r/min離心15 min,取上清液冷凍干燥。將凍干的酶解產物配成濃度為100 μg/mL溶液,采用MTT法檢測5組酶解產物對RAW 264.7細胞增殖的影響,并計算相對增殖率,篩選出最佳酶解的蛋白酶。

1.2.4 單因素實驗 在1.2.3篩選出最適蛋白酶的情況下,研究影響酶添加量、料液比、酶解溫度、pH和酶解時間對日本黃姑魚肉酶解的影響。酶解的基本條件為加酶量1500 U/g、料液比1∶10 (g/mL)、溫度60 ℃、pH6.0、時間6 h。改變其中的1個條件,分別考察蛋白酶的添加量(500、1000、1500、2000、2500 U/g),料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL),酶解溫度(50、55、60、65、70 ℃),pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)和酶解時間(2、4、6、8、10 h)對酶解效果的影響,MTT法檢測相對增殖率。

1.2.5 響應面試驗設計 在單因素實驗結果的基礎下,以酶解溫度、酶解時間、料液比和pH為工藝參數,設計四因素三水平Box-Behnken響應面試驗,以日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率為指標,設計5個中心點和29個不同組合的試驗,試驗因素水平如表1所示。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率的測定 參考葉盛旺等[4]方法,稱取一定量的日本黃姑魚肉多肽,用細胞培養液配成100 μg/mL的濃度。采用MTT法檢測其對RAW264.7細胞增殖的影響。按式(1)計算相對增殖率。

相對增殖率(%)=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/空白對照組OD值×100

式(1)

1.3 數據分析

采用Design Expert 8.05b對響應面試驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

5種蛋白酶酶解產物對RAW 264.7細胞的相對增殖率情況如圖1所示。由圖1可知,木瓜蛋白酶酶解產物對RAW 264.7細胞的相對增殖率最高為53.60%,其后依次為中性蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶,胰蛋白酶酶解產物對RAW 264.7細胞的相對增殖率最低。故選擇木瓜蛋白酶為本實驗最優提取酶。

圖1 不同蛋白酶對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effect of different proteases on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2 單因素實驗

2.2.1 加酶量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖2所示為加酶量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。酶添加量由500 U/g增加到2000 U/g時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞的相對增殖率持續升高,這是因為酶添加量增加,底物反應越徹底,在酶添加量達到2000 U/g時,對RAW 264.7細胞相對增殖率最高。當酶添加量繼續增加時,底物已經充分酶解,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率不再隨著酶添加量的增多而升高,反而有略微下降的趨勢,這可能是生成的多肽被再次酶解導致的。因而最適酶添加量為2000 U/g。

圖2 酶添加量對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.2 料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖3所示為料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當料液比為1∶10 (g/mL)時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率達到最大。料液比在1∶6～1∶14范圍內時,隨著料液比的增加,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率先升高后降低。這是由于在一定的范圍內,增加酶解體系中的料液比,酶與底物接觸逐漸充分,酶解程度不斷增大。但是隨著料液比越來越大,底物被過多稀釋,這反而增大了酶與底物的接觸難度,導致體系酶解不完全,蛋白質難以被分解成具有免疫活性的肽[17]。因此,最佳料液比為1∶10 (g/mL)。

圖3 料液比對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.3 Effect of ratios of water to material on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.3 酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖4所示為酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。溫度由50 ℃升高至60 ℃時,酶解效果越來越好,日本黃姑魚肉酶解多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率越來越高。當酶解溫度在60～70 ℃時,相對增殖率開始下降。這是因為在一定的溫度范圍內,隨著溫度的升高,酶活力開始增大,酶與底物結合程度開始提高,有利于提取免疫活性肽;但溫度過高會導致蛋白質變性,不僅降低了酶活力,而且會引起蛋白質的聚集和沉淀作用,使其溶解度下降,不利于提取免疫活性肽[18]。因此,最佳酶解溫度為60 ℃。

圖4 酶解溫度對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.4 Effect of enzymatic temperature on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.4 pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖5所示為pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當pH為6.0時,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率最高,達到58.44%。在pH4.0～8.0的范圍內,隨著pH的升高,日本黃姑魚肉多肽對RAW 264.7細胞相對增殖率先逐漸升高后逐漸降低。pH能影響酶活性部位的解離和底物蛋白的解離,從而直接影響了酶與底物蛋白的結合與催化,每個催化反應都有一個最適的pH[19]。因此,最佳pH為6.0。在細胞培養過程中,培養液的pH對細胞活力有一定的影響[14],因此,為考慮酶解液中pH對細胞活力產生的影響,將滅酶活后的酶解液調至中性再進行后期實驗,以防pH對細胞的活力有影響,進而影響各酶解條件的篩選。

圖5 pH對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.5 Effect of pH on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.2.5 酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響 圖6所示為酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響。當時間在2～6 h時,酶解產物對RAW 264.7細胞相對增殖率越來越高,當酶解時間達到6 h時,相對增殖率達到最高。當時間在6～10 h時,酶解產物對RAW 264.7細胞相對增殖率開始降低。這可能是因為酶解時間延長,酶解反應中一些具有高免疫活性的肽鏈被再次酶解,導致相對增殖率降低[20]。故選擇酶解時間為6 h左右。

圖6 酶解時間對RAW 264.7細胞相對增殖率的影響Fig.6 Effect of enzymatic time on relative proliferation rate of macrophage RAW 264.7

2.3 響應面試驗

2.3.1 模型建立與顯著性檢驗 在單因素實驗結果的基礎上,選取料液比、pH、酶解溫度、酶解時間進行4因素3水平的響應面優化試驗,以日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的相對增殖率為響應值,分析日本黃姑魚肉酶解的最優工藝指標。響應面試驗的設計與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Design and results for the Box-Behnken experiment

各因素經過回歸擬合后,得到料液比、pH、酶解溫度、酶解時間的二次多項回歸方程為:

相對增殖率=60.42-1.29A+4.64B+0.52C+5.16D-2.16AB+1.88AC-2.70AD-2.66BC-3.71BD-2.31CD-6.37A2-20.68B2-3.46C2-5.09D2。

表3 回歸模型及方差分析Table 3 Variance analysis for regression equation

2.3.2 響應面交互作用分析 響應面圖是回歸方程的形象描述,響應面曲面可較直觀地反映各因素及兩兩因素的交互作用對響應值的影響[21-23]。響應面圖曲面坡度陡峭、等高線密集成橢圓形表明兩因素交互影響大,而坡度平緩、等高線呈圓形則表明兩因素之間交互影響小[24-25]。各因素交互作用對小鼠巨噬細胞RAW 264.7相對增殖率的影響如圖7所示。由圖7可以直觀地看出,各試驗因素的交互作用不顯著,與方差分析結果一致。

圖7 各因素之間交互作用的響應曲面圖Fig.7 Response surface diagrams for interaction of various factors

2.4 驗證實驗

經Design Expert 8.05b軟件分析得到的最佳酶解條件為料液比1∶11.2 (g/mL)、pH6.1、酶解時間5.4 h、酶解溫度58.8 ℃。在此條件下,日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬RAW 264.7細胞增殖率的預測值為62.3%。為了驗證響應面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進行日本黃姑魚肉多肽對小鼠巨噬細胞RAW 264.7的增殖率的驗證實驗,同時考慮到實際操作等因素,修正工藝參數為:酶解時間5.4 h、料液比1∶11 g/mL、酶解溫度59 ℃、pH為6,進行3次平行實驗得到的增殖率為61.8%±0.5%,與預測值62.3%無顯著性差異。因此,通過響應面法優化提取日本黃姑魚肉多肽的酶解條件是可行的,得到的日本黃姑魚肉多肽提取條件的回歸模型較可靠。

3 結論與討論

根據實驗分析,確定提取日本黃姑魚肉多肽所用的蛋白酶為木瓜蛋白酶。通過Box-Behnken響應面試驗設計得到了日本黃姑魚肉多肽提取的最優工藝參數為料液比1∶11 (g/mL)、pH為6、酶解時間5.4 h、酶解溫度59 ℃。通過驗證實驗所得得到的增殖率為61.8%±0.5%,與模型預測值接近,證明應用響應面法優化提取日本黃姑魚肉多肽是準確可行的,為日本黃姑魚魚肉提取免疫活性肽奠定基礎,為進一步研究其免疫調節作用機制提供參考。

本研究探討了日本黃姑魚肉免疫多肽的制備工藝,其實質就是酶反應條件對產物活性成分的影響。只有調節合適的pH、酶解溫度和酶解時間,用適當的蛋白酶進行酶解,才可以產生有生理活性的免疫活性肽[26]。經大量免疫活性肽研究中發現免疫活性肽通常具有疏水性氨基酸,其活性與母體蛋白的氨基酸組成、亞基序列、空間結構有關[27]。因此,調節酶反應條件達到最佳的酶解效果,提取的日本黃姑魚肉多肽才能具有最強的免疫活性。