赤霞珠葡萄梗黃酮、原花青素和多酚的提取工藝優化

李彩霞,焦 揚,崔 瑋,古小梅,張永博

(1.河西學院農業與生物技術學院,甘肅張掖 734000; 2.甘肅省高校河西走廊特色資源利用省級重點實驗室,甘肅張掖 734000)

葡萄梗是葡萄深加工的主要廢棄物,資源豐富,并含有豐富的膳食纖維、蛋白質和單寧[1-3]、黃酮、原花青素、白黎蘆醇等活性成分[4-5],這些成分具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗突變、抗腫瘤、消炎、預防心腦血管疾病、防治冠心病及中風等多種藥理功能[5-8]。目前,葡萄及其副產品的研究主要集中在果皮、籽活性成分的提取與分析,而對于葡萄梗的研究相對滯后,李浡等[5]對葡萄梗中的多酚物質進行了提取和分析,發現綠原酸含量較高;陳國剛等[9]對葡萄梗中單寧的提取工藝進行了優化,其提取率為9.37%;康彥芳等[10]以葡萄酒廠釀酒后廢棄物葡萄梗為原料,采用超聲波輔助法對葡萄梗中的白藜蘆醇進行了提取。以上研究主要針對葡萄梗廢棄物中單一組分的提取或報道,而對于黃酮、原花青素和多酚系統提取的研究尚未見報道。對葡萄梗黃酮、原花青素和多酚進行系統提取,能夠在一定程度上減少葡萄梗資源的浪費,提高葡萄梗的附加值及提取效率,避免單一指標提取的繁瑣性,具有重要意義。

乙醇-硫酸銨雙水相體系與其他高聚物的雙水相萃取相比,具有低廉、低毒、分相清晰,萃取相粘度小,有機溶劑用量少等特點[11],該技術廣泛應用在生物工程、食品、制藥等領域。

本文以張掖板橋莊園赤霞珠葡萄梗為原料,以葡萄梗中黃酮、原花青素和多酚含量的綜合評分為評價指標,采用正交試驗優化超聲輔助雙水相提取葡萄梗黃酮、原花青素和多酚的工藝,以期為葡萄梗的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄梗 甘肅省濱河食品有限公司(原料來源于張掖板橋莊園),樣品挑去雜質,清洗干凈,陰干,粉碎過60目保存備用;無水乙醇(相對密度0.7893)、甲醇 天津市光復科技有限公司 色譜純;硫酸銨、濃鹽酸、氫氧化鈉 天津百世化工有限公司 分析純;兒茶素 純度≥99%，上海友思生物技術有限公司;蘆丁、沒食子酸、香草醛 純度≥98%，國藥集團化學制劑有限責任公司。

KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;SHB-IIIA循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;DR6000紫外可見分光光度計 美國哈希;RE-2000A型旋轉蒸發器 鞏義市京華儀器有限責任公司;SHZ-2000型循環水式真空泵 河南省鞏義市英峪予華儀器廠;BT125D電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同提取溶劑的選擇 準確稱取赤霞珠葡萄梗粉末1 g,按料液比1∶20 (g/mL)分別加入50%乙醇、95%乙醇、無水乙醇及乙醇-硫酸銨雙水相體系,雙水相的配制參照文獻[12],在35 ℃超聲(40 kHz、250 W)提取40 min,各提取液(雙水相提取液置于分液漏斗中,分相,分出上相)定容至50 mL,分別測定各提取液的原花青素、黃酮和多酚含量。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 超聲時間對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響 配制乙醇質量分數為24%、硫酸銨質量分數為20%的雙水相40 mL 5份,分別加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超聲提取20、30、40、50、60 min,抽濾,濾液于分液漏斗中靜置分層,將上相定容至50 mL,測定上相中原花青素、黃酮和多酚的含量,考察超聲時間對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響。

1.2.2.2 乙醇質量分數對原花青素、黃酮和多酚提取的影響 配制乙醇質量分數為20%、21%、22%、23%、24%、25%,硫酸銨質量分數為20%的雙水相,按料液比1∶40 (g/mL)分別加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超聲提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察乙醇對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響。

1.2.2.3 硫酸銨質量分數對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響 配制硫酸銨質量分數為18%、19%、20%、21%、22%,乙醇質量分數為24%的雙水相,按料液比1∶40 (g/mL)分別加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超聲提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察硫酸銨對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響。

1.2.2.4 料液比對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響 固定超聲時間50 min、乙醇質量分數24%,硫酸銨質量分數20%,配制1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50 (g/mL)的雙水相,分別加入1 g葡萄梗粉末,在35 ℃超聲提取50 min,之后按1.2.2.1方法操作,考察料液比對葡萄梗原花青素、黃酮和多酚提取的影響。

1.2.3 正交試驗優化提取工藝 在單因素實驗的基礎上,根據正交試驗設計原理,以原花青素、黃酮和多酚的含量及其綜合評分為考察指標,對超聲時間、乙醇質量分數、硫酸銨質量分數和料液比設計4因素3水平方案[13],因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of orthogonal experiment

1.2.4 原花青素含量的測定 原花青素含量測定參照文獻[14]的香草醛鹽酸比色法,以兒茶素為基準物,得到兒茶素標準溶液吸光度與兒茶素質量(mg)的線性回歸方程y=4.985x+0.0215,R2=0.9993,根據回歸方程計算原花青素的質量,原花青素的含量按下式計算。

式中:c為標準曲線中查的原花青素的質量(mg);vt為提取液總體積(mL);n為稀釋倍數;w為樣品重量(g);vs為測定液體積(mL)。

1.2.5 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定采用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉比色法[15],以蘆丁作為標準物,得到蘆丁標準溶液的吸光度與蘆丁質量(mg)的線性回歸方程為y=1.1721x-0.0033,R2=0.9995。并根據回歸方程計算黃酮的質量,按下式計算黃酮含量。

式中:c為標準曲線中查得黃酮的質量(mg);vt為提取液總體積(mL);n為稀釋倍數;w為樣品重量(g);vs為測定液體積(mL)。

1.2.6 多酚含量的測定 多酚含量的測定參照GB/T 8313-2018[16]的方法,以沒食子酸作為標準品,采用福林酚試劑法繪制標準曲線,得回歸方程為y=0.0139x+0.005,線性范圍為0～50 μg,R2=0.9997。根據回歸方程計算樣品中多酚質量,按下式計算多酚的含量。

式中:c為標準曲線中查得多酚的質量(μg);vt為提取液總體積(mL);n為稀釋倍數(g);w為樣品重量;vs為測定液體積(mL)。

1.2.7 綜合評價方法 以多酚、黃酮和原花青素3個指標的含量為評價指標進行綜合評價,綜合評價根據衛陽非等[17]介紹的方法:將各指標首先均標準化為0～1之間的“歸一值”,對取值越大越好的指標,采用計算公式:di=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin);再將各指標的“歸一值”求幾何平均數得總評OD 值,公式為OD=(d1d2…dk)1/k(k為指標個數)。

1.3 數據處理

數據處理用Excel 2003軟件,利用DPS 12.5軟件進行方差分析、Turkey多重比較(P<0.01為差異極顯著),采用Origin 7.5軟件作圖,圖中數據均為三次重復的平均值加標準差。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑對葡萄梗黃酮、原花青素和多酚提取效果的影響

由圖1可知,4種提取溶劑中50%乙醇提取的黃酮含量最高,為69.36 mg/g,與雙水相提取(66.85 mg/g)相比差異不顯著(P>0.05),但極顯著高于其它兩種溶劑(P<0.01);原花青素和多酚的含量以雙水相作為提取溶劑提取效果最好,顯著高于(P<0.05)50%乙醇、95%乙醇和無水乙醇的提取效果。雖然50%乙醇提取的黃酮含量高于雙水相提取,但原花青素和多酚的含量均低于雙水相提取,從提取效果來看,雙水相提取效果最好,無水乙醇提取效果最差,這種差異可能和提取物質的分子結構、溶液極性等因素有關[18]。為了得到更高的黃酮、原花青素和多酚的含量,后續重點考察超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取葡萄梗中黃酮、原花青素和多酚的工藝參數。

圖1 不同提取溶劑對葡萄梗原花青素、黃酮、多酚含量的影響Fig.1 Effects of different extractants on PC, flavonoids and polyphenols contents注:不同大寫字母表示同一指標各組間差異 極顯著(P<0.01);圖2～圖5同。

2.2 單因素實驗

2.2.1 超聲時間對原花青素、黃酮和多酚提取的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的延長,原花青素、黃酮和多酚的含量整體趨勢均在上升,在超聲時間50 min時達到最高值,分別為87.33、122.72、72.05 mg/g,而后均下降,原花青素和多酚下降趨勢較大。這是由于超聲波引起的“空化效應”,有助于酚類物質的滲透,使原花青素、黃酮和多酚的含量增高,但是進一步延長超聲時間,會使溶液溫度升高,酚類成分發生氧化、降解,含量有所下降[19]。因此超聲時間在50 min比較合適。

圖2 超聲時間對葡萄梗原花青素、黃酮、多酚含量的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.2 乙醇質量分數對原花青素、黃酮和多酚提取的影響 從圖3可以看出,隨著乙醇質量分數的增大,黃酮、多酚和原花青素的變化均呈現上升趨勢,在乙醇質量分數為24%時均出現最大值,且與其它乙醇質量分數的提取效果差異極顯著(P<0.01),繼續增大濃度,原花青素、黃酮和多酚的含量呈下降趨勢,其原因是乙醇質量分數增大,親脂性成分溶出,而酚類物質的溶出降低[13],導致其黃酮、多酚和原花青素的含量降低,故乙醇質量分數以24%左右為宜。

圖3 乙醇質量分數對葡萄梗原花青素、黃酮、多酚含量的影響Fig.3 Effects of mass fraction of ethanol on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.3 硫酸銨質量分數對原花青素、黃酮和多酚提取的影響 由圖4可知,(NH4)2SO4質量分數在18%～20%之間時,原花青素、黃酮和多酚的含量逐漸增大并達到最大值,分別為87.37、122.93、72.48 mg/g,極顯著(P<0.01)高于(NH4)2SO4其它質量分數的提取效果,當大于20%時,原花青素、黃酮和多酚的含量逐漸降低。其原因是隨著(NH4)2SO4用量的增加,(NH4)2SO4對水的束縛能力增強,乙醇從(NH4)2SO4水相中游離出來,而水分子也離開乙醇相,導致上相的乙醇體積增加,而下相相對降低,最終改變了上相的極性,從而影響了酚類成分在其上下相的分配[20]。因此選擇(NH4)2SO4用量為20%左右。

圖4 硫酸銨質量分數對葡萄梗原花青素、黃酮、多酚含量的影響Fig.4 Effects of mass fraction of ammonium sulfate on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.2.4 料液比對原花青素、黃酮和多酚提取的影響 由圖5可知,隨著料液比的增大,原花青素、黃酮、多酚的含量也隨著增大,在料液比1∶40 (g/mL)時,原花青素、黃酮和多酚的含量達到最大,且與其它料液比的提取效果相比較差異極顯著(P<0.01)。當料液比高于1∶40 (g/mL)時各指標均下降。這是因為在超聲提取過程中,溶劑的用量越多,其相應的傳質動力就越大,擴散到溶劑里的酚類化合物就越多[19]。但是,在產生相同熱量的條件下,由于液料比的增大,使提取液溫度下降,固相和液相之間的平衡降低,導致提取效果的降低。從提取效果來看,選擇料液比為1∶40 (g/mL)左右為宜。

圖5 料液比對葡萄梗原花青素、黃酮、多酚含量的影響Fig.5 Effects of material liquid ratio on PC, flavonoids and polyphenols contents

2.3 正交試驗及結果

在單因素實驗的基礎上,以超聲時間、硫酸銨質量分數、乙醇質量分數和料液比為自變量,分別以多酚、黃酮和原花青素的含量為因變量,建立9個處理組,正交設計方案所得的試驗結果見表2。以多酚、黃酮和原花青素3個指標的含量為評價指標進行綜合評分,綜合評分的極差和方差分析見表3,從表3極差可知各因素對綜合評分的影響的主次為D(料液比)>B(硫酸銨質量分數)>A(超聲時間)>C(乙醇質量分數),由表2可知,在4個影響因素中,乙醇質量分數的極差最小,將其作為誤差項做方差分析,方差分析見表3。從表3方差分析可以看出,各因素影響均不顯著(P>0.05),從F值來看,F值越大,對各指標的影響就越大,料液比的F值最大,說明料液比對原花青素、黃酮和多酚提取影響最大,和極差分析結果一致。結合表2可知,超聲輔助雙水相綜合提取葡萄梗原花青素、黃酮和多酚的最優組合為A2B2C2D2,即超聲時間50 min、硫酸銨質量分數20%、乙醇質量分數為24%、料液比為1∶40 (g/mL)。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 正交設計方差分析表(完全隨機模型)Table 3 Variance analysis of orthogonal design(complete random model)

2.4 驗證試驗

對綜合優化的工藝進行5組重復放大試驗(料液比放大8倍),赤霞珠葡萄梗多酚、黃酮、原花青素的含量分別為72.85、122.21、87.67 mg/g,此時的最大評分為1.001,與表2中序號2的綜合評分接近,表明采用正交設計,綜合評分法優化超聲輔助乙醇-硫酸銨雙水相提取赤霞珠葡萄梗中多酚、黃酮和原花青素的工藝具有可行性。

3 結論

本研究比較了幾種提取溶劑對赤霞珠葡萄梗黃酮、原花青素和多酚提取的效果,結果表明,利用雙水相法萃取葡萄梗中黃酮、原花青素和多酚,各指標均富集在上相有機溶劑中,目標成分明顯高于無水乙醇、95%乙醇、50%乙醇的提取,且水溶性成分富集在下相,目標物質易于分離和回收,同時所用試劑乙醇低毒,適宜工業化大規模生產。通過單因素實驗及正交試驗設計,采用多指標綜合評分法優化得到超聲輔助雙水相提取赤霞珠葡萄梗中黃酮、原花青素和多酚的工藝為:超聲提取時間50 min、乙醇質量分數24%、硫酸銨質量分數20%、料液比(1∶40) g/mL。此條件下,赤霞珠葡萄梗中多酚、黃酮、原花青素的含量分別為72.85、122.21、87.67 mg/g。本研究在優選提取工藝時,選用多酚、黃酮及原花青素3個指標為評價指標,利用多指標歸一化對數據進行處理,該工藝避免了采用單一指標提取的局限性,同時減少重復提取指標的繁瑣性,降低成本,使評價指標更加科學合理。