高效液相色譜-碰撞/反應池-電感耦合等離子體質譜測定貝類中砷形態化合物及健康風險評估

王志鵬,薛長湖,2,*,徐 杰,李兆杰

(1.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003; 2.青島市海洋科學技術國家實驗室,山東青島 266003)

貝類,屬軟體動物門中的雙殼綱或瓣鰓綱,常見的貽貝、牡蠣、蟶、蛤等都屬此類,現存貝類的種類1.1萬種左右。海洋貝類由于味道鮮美,并且含有豐富的蛋白質,低脂肪且脂肪多為不飽和脂肪酸(ω-3和ω-6),富含多種人體必需礦物質、維生素,深受沿海居民的喜愛[1]。近年來,隨著人們環保意識的不斷增強以及對食品安全關注的與日俱增,貝類的食用安全性評價,尤其是會對人體健康產生重要影響的有毒有害元素殘留問題,備受國內外學者的關注[2]。

砷,一種具有準金屬特性的非金屬元素,具有與其他重金屬元素類似的毒性。研究發現,砷元素的毒性不僅與其總含量相關,而且很大程度上取決于砷元素的形態[3]。水產品中砷可以分為無機砷(三價砷As(Ⅲ)、五價砷As(V))和有機砷(一甲基砷MMA、二甲基砷DMA、砷甜菜堿AsB、砷膽堿AsC等)兩大類。無機砷是砷元素化合物致癌、致畸的主要來源,有機砷通常被認為是低毒性或者無毒性的,以半致死量(lethal dose 50,LD50)計,毒性按大到小依次為As(Ⅲ)>As(V)>MMA>DMA>AsB>AsC[4-5]。因此,建立有效提取和準確測定砷形態化合物的方法對于水產品中砷元素食用安全性評價具有重要意義。

目前元素As的檢測方法有:原子吸收光譜法(Atomic Absorption Spectroscopy,AAS),該方法具有操作簡單、維護成本低等優點,但不能同時測定多種元素[6];原子熒光光譜法(Atomic Fluorescence Spectrometry,AFS),該方法干擾較小、譜線簡單,但能分析的元素種類有限[7];電感耦合等離子體原子發射光譜法(Inductively Coupled Plasma Optical Emission Spectrometer,ICP-OES),該方法線性范圍寬、靈敏度較高,并且能實現多元素的同時測定,但在測定過程中光譜干擾對測定結果影響較大[8];電感耦合等離子體質譜法(ICP-MS),對比前三種方法,該方法在分析靈敏、準確性、抗干擾能力方面均具有優勢[9]。在海產品砷元素的測定過程中,樣品中含有高濃度的氯元素和其他元素,會產生嚴重的多原子離子干擾問題[10]。隨著現代科學技術的高速發展,配備八極桿碰撞反應池系統(Octopole Reaction System,ORS)的ICP-MS通過在碰撞/反應池(CRC)中通入氣體(He、O2或其他氣體),與離子束中離子進行碰撞或反應來消除Ar氣、空氣、水、試劑及其他復雜基體如雙電荷離子所產生的各種類型的質譜干擾[11],是解決四極桿ICP-MS(ICP-QMS)質譜干擾問題的一個重大技術突破,并且迅速發展為目前ICP-MS最有效的質譜干擾消除技術。

本研究以青島市售貝類樣品為研究對象,微波消解后采用基于碰撞/反應池技術的ICP-MS法測定其中砷元素含量,分析在不同貝類中砷元素的分布情況,并且通過HPLC-ICP-MS對其中砷元素形態進一步探究,依據國家對砷元素的限量標準,結合當地貝類消費量,并與美國環境保護局(USEPA)推薦的健康風險模型和健康風險,對貝類的污染狀況和食用安全性進行科學評估。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣、蛤蜊、毛蚶、扇貝、縊蟶、竹蟶、青口貝、北極貝、夏威夷貝共9種 青島南山水產市場和團島水產市場;1 μg/L(Li、Mg、Y、Ce、Tl、Co)調諧溶液、100 μg/mL(Bi、Ge、In、Li、Lu、Rh、Sc、Tb)內標溶液、10 μg/mL砷元素標準溶液 美國Agilent公司;砷形態物質標準溶液:AsC((28.0±1.1) μg/g)、AsB((38.8±1.1) μg/g)、MMA((25.1±0.8) μg/g)、DMA((25.1±0.8) μg/g)、As(V)((17.5±0.4) μg/g)、As(Ⅲ)((75.7±1.2) μg/g) 國家標準物質中心;65%硝酸(色譜純) 默克公司;碳酸銨(色譜純) 阿拉丁公司;標準參考物質SRM 1566b(總砷含量:((7.65±0.65) mg/kg) 美國國家標準與物質研究所;所用玻璃器皿及聚四氟乙烯消解罐內罐 均需以20%的硝酸溶液浸泡24 h以上,再用超純水漂洗3次,最后儲存在密封的塑料容器中防止再次污染。

1260 HPLC高效液相色譜儀 美國Agilent公司;8800 ICP-MS電感耦合等離子體質譜(配有Micromist標準霧化器、Scott雙通道霧化室、在線內標添加組件包、Ni接口錐、雙四極桿、CRC池和MassHunter數據處理軟件) 美國Agilent公司;Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm) 瑞士Hamilton公司;XT-mul新拓微波消解儀(配有消解罐) 上海新拓儀器公司;LPHA 1-4 LD plus冷凍干燥機 德國Christ公司;Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司;AX124ZH分析電子天平 常州奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 砷元素標準工作液:將砷元素標準儲備液進行逐級稀釋,配制成濃度分別為0.0、0.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/L;砷形態標準工作液:取六種砷形態化合物標準溶液進行逐級稀釋,配制成濃度分別為0.0、0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0 μg/L。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 總砷測定前處理 貝類去殼,取用超純水漂洗三次去除外來雜質,研磨混勻,取樣0.5 g(精確到0.0001 g)于微波消解罐中,加入5 mL濃硝酸,冷消化30 min后,將消解罐放入微波消解系統中,升溫功率1200 W,升溫時間5 min,運行溫度120 ℃;在3 min內升至180 ℃,功率1800 W,保持15 min[12]。微波消解完畢后,待消解液冷卻后,將消解液轉移至50 mL容量瓶中,用少量超純水洗滌內罐3次,合并洗滌液并定容至刻度,混勻后過0.45 μm濾膜上ICP-MS分析總砷含量。同時做空白對照實驗。

1.2.2.2 砷形態測定前處理 準確稱量均質后的貝類樣品0.3 g(精確到0.0001 g)于50 mL離心管中,加入20 mL 0.15 mol/L的硝酸溶液,3000 r/min渦旋1 min,使提取溶液與樣品充分混合。80 ℃加熱30 min,然后超聲(200 W)水浴5 min,重復上述步驟5次。提取完畢后,取出冷卻至室溫,8000 r/min離心10 min,取上層清液于50 mL容量瓶中,并定容至刻度,混勻后過0.45 μm濾膜后上HPLC-ICP-MS分析砷形態化合物含量。同時做空白對照實驗。

1.2.3 色譜條件的優化 使用Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱優化流動相組成,選擇碳酸銨-水體系作為流動相,通過控制單一因子變量來探究流動相離子濃度和pH對色譜峰形的影響。在流動相pH=9.5的條件下,碳酸銨濃度分別為30、40、50、60 mmol/L對六種砷形態化合物色譜分離的影響;在碳酸銨濃度為50 mmol/L的條件下,流動相pH分別為9.0、9.3、9.5、9.8對六種砷形態物質色譜分離的影響。

1.2.4 儀器條件 HPLC工作參數:Hamilton PRP-X100陰離子色譜柱(250 mm×4.1 mm,10 μm);流動相A:水,流動相B:50 mmol/L碳酸銨溶液(pH=9.5);梯度洗脫:0～3 min,100% A,3～4 min,0%～100% B,4～12 min,100% B;流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃。

ICP-MS工作參數:分析模式為全定量分析,射頻功率1550 W,等離子氣流速15.0 L/min,輔助氣流速1 L/min,載氣流速1.05 L/min,補償氣流速0.35 L/min,蠕動泵轉速0.3 r/s,采樣深度10.1 mm,數據重復采集3次,積分時間為0.1 s,掃描類型為單桿/串接,采用ICP-MS中的No gas模式、He模式、O2三種模式依次測定標準溶液。

1.2.5 方法學考察

1.2.5.1 標準工作曲線的繪制 在上述最佳儀器條件下,將砷元素標準溶液按照濃度從低到高依次在ICP-MS中進樣,測定砷元素的信號值,繪制標準曲線;將6種砷形態混合標準溶液按照濃度從低到高依次在HPLC-ICP-MS中進樣,對各砷形態化合物的色譜峰面積進行積分,繪制標準曲線。

1.2.5.2 檢出限和定量限 通過對空白溶液連續測定11次,以空白樣品的信號值計算出標準偏差值,以測定結果標準偏差值的3倍計算檢出限,以測定結果標準偏差的10倍計算定量限。

1.2.5.3 精密度和回收率實驗 為了驗證實驗結果的準確性,將標準參考物質SRM 1566b中分別加入不同水平的標準品,進行加標回收實驗,采用HPLC-ICP-MS法測定其中砷形態含量,并計算其回收率。

1.2.6 樣品的測定 將每種貝類樣品設置6個平行樣(n=6),按照上述實驗方法進行前處理,采用ICP-MS分析總砷含量,HPLC-ICP-MS分析砷形態化合物含量,測定數據為6次測定的平均值。

1.2.7 健康風險評估 采用USEPA推薦的日暴露計算方法和健康風險模型評價貝類中砷的健康風險。日膳食暴露量(estimated daily ingestion,EDI)的計算公式為:

式中:EDIiAs為iAs的日膳食暴露量(mg/(kg·d));CiAs為貝類樣品中iAs含量(mg/kg);DIR為目標人群貝類的攝入量(0.0389 kg/d);BW為目標人群的平均體重(63 kg)[13]。

采用危害商數(target hazard quotient,THQ)來評價由于攝入污染物對人體健康造成的潛在風險。THQ是污染物的估計劑量與參考劑量的比值,如果比值超過安全基準1,則說明這種污染物對人體具有潛在的健康風險[14]。計算公式為:

式中:THQiAs為無機砷的危害商數;RfDiAs為無機砷的口服參考劑量(3.0×10-4mg/(kg·d));EF為暴露頻率(365 d/year);ED為暴露年限(70 years);AT為暴露平均時間(25550 d)[15]。

采用致癌風險(carcinogenic risk,CR)來評估攝入貝類后無機砷對人群產生的健康風險。計算公式為:

式中:CRiAs為癌癥風險概率;SFiAs(kg·d/mg)為砷的致癌因子(1.5 kg·d/mg)[16]。

1.3 數據處理

本研究中實驗中設置6組平行,數據以平均值±標準偏差表示;數據處理軟件采用MassHunter軟件,數據分析通過Eexcel 2016和SPSS 25.0,繪圖軟件采用Origin Pro 9.0。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

采用濃度分別為30、40、50、60 mmol/L的碳酸銨水溶液(pH=9.5)作為流動相分離6種砷形態化合物,4種不同濃度碳酸銨下的HPLC-ICP-MS色譜圖如圖1a所示。由圖1a可知,隨著碳酸銨的濃度增加,六種砷形態化合物的洗脫時間縮短,尤其是As(V)和MMA,但AsC和AsB的洗脫時間基本不變。當流動相濃度超過50 mmol/L時,As(Ⅲ)與DMA分離效果不佳。因此流動相碳酸銨的最佳離子濃度為50 mmol/L,在該條件下,6種砷形態化合物可在12 min內洗脫,對比Jasrotia等[17]分析海藻植物中中五種砷形態化合物需要18 min,分析效率得以提高。

采用pH分別為9.0、9.3、9.5、9.8的碳酸銨(50 mmol/L)作為流動相分離6種砷形態化合物,4種不同pH條件下的HPLC-ICP-MS色譜圖如圖1b所示。由圖1b可知,隨著流動相pH增加,AsC、AsB、DMA、As(V)的洗脫時間幾乎不受影響,但As(Ⅲ)逐漸電離,信號增加,并且出峰時間延后。當流動相pH為9.8時,As(Ⅲ)與MMA不能達到基線分離。綜合考慮As(Ⅲ)的信號值與色譜分離效果,選擇流動相B的pH為9.5,此時6種砷形態化合物均可獲得良好的分離效果,且峰形尖銳。

圖1 砷形態化合物在不同條件下的HPLC-ICP-MS色譜圖Fig.1 HPLC-ICP-MS chromatograms of As species standards under different conditions注:1:AsC,2:AsB,3:As(Ⅲ),4:DMA,5:MMA, 6:As(V);a:不同離子濃度;b:不同pH。

2.2 提取條件對貝類中砷形態物質提取效率的影響

為了確定貝類樣品中砷形態化合物的組成,需要選擇合適的提取條件進行前處理,既要保證砷形態化合物穩定的同時,又能夠達到較好的提取效率(提取六種砷形態總和/樣品中總砷含量)。本研究以標準參考物質SRM 1566b為原料,采用四種不同的酸性試劑硝酸、甲酸、鹽酸、三氟乙酸進行提取,提取效率如圖2a所示。結果表明,在酸濃度一定(0.3 mol/L)時,硝酸對砷形態的提取效率優于其他提取試劑。在選擇以硝酸作為提取試劑后,分別比較濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L的硝酸溶液作為提取試劑對提取效果的影響,提取效率如圖2b所示。結果表明,隨著硝酸濃度的增加,提取效率不斷升高,說明酸有利于從貝類基質中提取砷形態化合物,而當硝酸濃度大于0.15 mol/L時,提取效率基本保持不變。考慮到酸性過高對色譜柱壽命的影響,本研究采用0.15 mol/L硝酸作為提取試劑進行貝類中砷形態化合物的提取實驗。

圖2 標準參考物質SRM 1566b在不同提取條件下砷的提取效率Fig.2 Extraction efficiency of As species from SRM 1566b under different conditions注:a:不同種類的提取試劑;b:不同濃度的提取試劑。

2.3 CRC模式的選擇

采用ICP-MS在不同CRC模式(SQ模式無氣模式、SQ模式的He碰撞模式和MS/MS模式下的O2反應模式)下進行總砷濃度的測定。砷元素在不同碰撞/反應模式下的線性方程、相關系數、背景等效濃度、檢出限和定量限見表1。由表1可知,本實驗三種模式下砷元素的標準曲線相關系數均達到0.9995以上,說明元素的信號值與濃度呈現出良好的線性關系。在No gas模式下,砷的背景等效濃度達到3.651 μg/L,表明在電感耦合等離子體質譜測定砷元素時存在著嚴重的多原子離子干擾(40Ar35Cl、40Ar34SH、40Ca35Cl)。在He碰撞模式下,砷元素的背景等效濃度降低到0.008 μg/L,雖然通過動能歧視和干擾離子碰撞解離使得多原子離子干擾基本被消除,但是對比He模式和其他模式下砷元素的標準曲線可知,其信號大大降低,這是因為在He模式下,不僅多原子離子會被消除,大量的75As+也會有能量損失,從而導致目標離子靈敏度受損嚴重。在O2模式下,第一個四極桿過濾器設為質荷比(m/z)=75,通過在碰撞/反應池中的質量轉移反應,將75As+轉移(shift)為75As16O+,第二個四極桿過濾器設置目標離子為(m/z)=91,而40Ar35Cl+、40Ar34SH+、40Ca35Cl+以及由稀土元素形成的雙電荷離子(150Sm++和150Nd++)不能與O2發生質量轉移反應,不僅能去除多原子離子干擾,還可以除去He模式下無法消除的雙電荷離子干擾,砷元素的背景等效濃度(BEC)降到了0.006 μg/L,而且相比于He模式靈敏度明顯提高,所獲得元素As的檢出限為0.009 μg/L,定量限為0.030 μg/L。Zhu等[18]通過ICP-MS中He模式分析砷元素,檢出限為0.1 μg/L,本研究采用O2模式,砷元素的檢出限更低,

表1 三種CRC模式下砷元素的分析性能Table 1 Analytical performance of three modes on arsenic

同時GB 5009.11-2014《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》[19]也推薦使用碰撞/反應池技術來測定樣品中砷元素。綜上,在本研究中,MS/MS模式下的O2反應模式測定砷元素具有良好的分析性能。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準工作曲線及檢出限、定量限 對六種砷形態化合物標準混合溶液進行HPLC-ICP-MS進行分析,以峰面積(y)對濃度(x,μg/L)進行線性回歸,同時將6種砷形態溶液按照濃度從低到高依次進樣,將信噪比S/N≥3時標準品的濃度定為檢出限,將S/N≥10時標準品的濃度定為定量限,實驗結果如表2所示。結果表明,在碰撞/反應池的O2模式條件下,6種砷形態化合物在一定濃度范圍內都呈現良好的線性關系,相關系數均在0.999以上,6種砷形態化合物檢出限為0.009～0.028 μg/L。Chen等[20]采用HPLC-ICP-MS中He模式分析蘑菇中砷元素形態,6種砷化合物的檢出限為0.31～0.59 μg/L,本文建立的方法通過采用碰撞/反應池技術,在檢測靈敏度上已經超過了該方法。綜上所述,本研究建立的CRC-ICP-MS元素分析方法具有很高的檢測靈敏度,適合水產品中砷形態化合物的定量分析。

表2 六種砷形態的標準曲線和靈敏度Table 2 Standard curves and sensitivity of six As species

2.4.2 精密度實驗 為了驗證本研究中建立的HPLC-ICP-MS方法的準確性,按照上述選定的實驗步驟和分析條件,對標準參考物質SRM 1566b進行分析,重復測定6次,分析結果見表3。由實驗結果可知,該方法具有良好的日內精密度和日間精密度(均小于10%),表明該方法具有較高的精密度和良好的準確性。

表3 標準參考物質分析結果Table 3 Analytical results of certified reference materials

2.4.3 加標回收實驗 本研究采用加標回收率來進一步驗證方法的準確性,在標準參考物質SRM-1566b中分別添加3種濃度水平的砷膽堿、砷甜菜堿、三價砷、一甲基砷、二甲基砷和五價砷的標準溶液,按照上述實驗進行處理測定,測定樣品加標前后六種砷形態化合物的濃度,計算加標回收率(n=6),結果見表4所示。實驗結果顯示,6種砷形態的回收率介于91.2%～106.2%,RSD介于3.2%～8.6%說明該方法有良好的重現性,滿足分析測試的要求。綜上所述,本研究中建立的方法能準確分析水產品中6種砷形態化合物的含量。

表4 樣品加標回收率結果Table 4 Recoveries of arsenic species from spiked samples

2.5 貝類樣品中總砷含量的測定

采用微波消解法進行前處理,運用ICP-MS中O2模式,以72Ge為內標,對牡蠣、蛤蜊、毛蚶、扇貝、縊蟶、竹蟶、青口貝、北極貝、夏威夷貝9種貝類樣品中的總砷含量進行測定,結果如表5所示。由表5可以看出,在測定的9種貝類(以濕重計)中,砷含量為0.70～1.79 mg/kg,其中竹蟶中砷含量最高,為1.79 mg/kg。Zmozinski等[21]分別研究了巴西和西班牙的海產品甲殼類、魚類、雙殼類中總砷含量(以干重計),從1.2～35.2 mg/kg之間,尤其是雙殼類動物中,砷平均含量達到15.0 mg/kg,其中無機砷含量占總砷含量的2.4%～5.8%。

表5 不同貝類中總砷含量Table 5 The contents of arsenic in different species of shellfish

根據GB2762-2017《食品中污染物限量》[22]中要求,海產品中貝類中無機砷含量小于0.5 mg/kg,為了對上述九種貝類進行無機砷風險評估,因此還需要進一步研究測定貝類中無機砷含量才能給出科學的食用安全性評價。

2.6 貝類樣品中砷形態測定與風險評估

采用優化好的前處理條件(0.15 mol/L硝酸溶液)、色譜分離條件(50 mmol/L碳酸銨)及ICP-MS中CRC的O2模式測定貝類樣品中砷形態化合物組成及其含量。分析結果如表6所示,在測定的九種青島市售貝類樣品中,砷元素主要以砷甜菜堿為主,約占總砷含量的59.4%～87.1%,無機砷含量在0.014～0.283 mg/kg,均低于中國食品安全國家標準中對貝類中無機砷(0.5 mg/kg)的限量[22]。

表6 貝類中6中砷形態化合物的濃度Table 6 Concentrations of six arsenic species in shellfish

在本研究中,通過EDIiAs、THQiAs、CRiAs來進一步評估人群攝入貝類后可能產生的危害,結果如表7所示,對于所測九種貝類樣品,無機砷的日攝入量在8.644×10-6～1.265×10-4mg/kg·d,危害商數THQ均小于1,說明青島市售的九種貝類就無機砷的食用安全性來說是安全的。但通過致癌因子CR可以看出,縊蟶、竹蟶、青口貝的致癌因子均大于無機砷致癌因子的最大可接受值(1×10-4)[23],說明應該適當減少部分貝類的食用量和使用頻率,以減少無機砷在體內蓄積,從而降低其致癌等危害。

表7 貝類的日攝入量及健康風險評估Table 7 Estimated daily intake and potential health risk from consumption of shellfish

3 結論

實驗研究了CRC不同模式下方法的準確性,表明O2反應模式是準確測定總砷及砷形態化合物的最佳定量方法。以0.15 mol/L硝酸作為提取試劑對貝類砷化合物進行提取,提取效率達90%,采用HPLC-ICP-MS法測定貝類樣品中As(Ⅲ)、As(V)、MMA、DMA、AsB和AsC六種砷形態化合物時,優化液相條件,以50 mmol/L碳酸銨(pH=9.5)進行梯度洗脫,使得6種砷形態化合物在12 min內得以分離,方法學考察顯示,該方法6種砷形態化合物檢出限為0.009～0.028 μg/L,日內精密度和日間精密度均小于10%,加標回收率介于91.2%～106.2%,具有良好的分析性能。

分析青島市售9種貝類樣品中砷元素和形態分布,結果表明,貝類中總砷濃度較高(0.70～1.79 mg/kg),但通過砷形態的測定結果發現,砷元素在貝類中主要是以無毒性的砷甜菜堿形式存在,約占總砷含量的59.4%～87.1%。根據風險評估的結果,青島市售的九種貝類樣品對人體基本沒有危害,但持續大量攝入部分貝類(縊蟶、竹蟶、青口貝)可能會產生潛在的致癌風險。本研究所建立的高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法方法靈敏度高,分析速度快,結果穩定準確,為食品中重金屬污染的安全性評價提供了指導。