鮮天麻采后生理品質變化規律及病原菌鑒定的研究

曹 森,雷霽卿,吉 寧,潘 成,馬 超,李 瑩,趙 宇,王 瑞 *

(1.貴陽學院食品與制藥工程學院,貴州貴陽 550005; 2.貴州省果品加工工程技術研究中心,貴州貴陽 550005; 3.貴州烏蒙騰菌業有限公司,貴州畢節 551600)

天麻(GastrodiaelataBl.)又稱赤箭、定風草、獨播芝等,為蘭科多年生異養寄生植物,屬于我國名貴中藥材,具有鎮靜、鎮痛、安眠、降血壓、增智等功效[1-3]。天麻的化學成分主要有多糖、酚類及其苷類等,其中酚類及其苷類是天麻的主要活性成分,如天麻素和對羥基苯甲醇等[4]。20世紀70年代天麻由野生變仿野生栽培后,栽培天麻成為主要商品來源,其種植主產地主要分布在云南、四川、貴州、湖北等地。另外,根據天麻莖桿顏色又可分為紅天麻、烏天麻和烏紅天麻等不同變型[5],其中烏天麻由于折干率高、商品性狀好、品質優良等特點被譽為國產天麻中的“極品”[6]。貴州是中國天麻的三大產區之一。其中畢節市是貴州天麻的主產區,種植面積達到4萬多畝,大方則是畢節地區天麻主要產地,種植面積達到2萬余畝,年產量200多萬公斤。大方天麻以天麻素和天麻多糖的含量高、微量元素豐富而受消費者的歡迎,其中天麻素含量是藥典標準的2～9.5倍。目前,天麻主要作為藥材使用,以炮制銷售為主[7-8]。

2018年1月11日,國家衛計委發布了《國家衛生計生委食品司關于就黨參等9種物質作為按照傳統既是食品又是中藥材物質開展試生產征求意見的函》,同意將天麻列入食藥物質目錄,隨著天麻列入食藥物質目錄,天麻作為食品的銷售和食用方式將越來越多,由于鮮天麻具有口感好、營養成分高、多種保健功能等優點,鮮食天麻也將越來越受歡迎。天麻也逐漸從傳統的單一炮制方式銷售模式,轉變為炮制品與生鮮天麻模式共同銷售。但鮮品銷售存在系列問題:天麻采收期集中且短,采收期當地天氣又是多雨季節,鮮天麻易腐爛,不耐貯藏,并且由于當地消費量有限,不能長時間貯藏;外銷又沒有好的貯運保鮮技術,在長途運輸中容易腐爛、發霉變質。目前,關于鮮天麻采挖后的報道較少,黃萬兵等[9]研究了鮮天麻保存中相關生理特性的研究,僅從天麻的生理和酶活性方面報道了相關變化。因此,系統地研究鮮天麻采后生理品質變化規律及病原菌鑒定,是天麻采后產業健康可持續發展面臨的重要問題。

本研究通過測定天麻在休眠期采收后,離開蜜環菌在貯藏期(25±0.5) ℃和(1±0.5) ℃的各種生理品質的變化規律,并探索貯藏期間引起天麻腐爛的主要致病菌,旨在為鮮天麻的留種保存及采后保鮮方法提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

烏天麻 采自貴州烏蒙騰菌業有限公司基地;Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259-50 次、DNA Marker DL2000和引物ITS1/ITS4 均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;腺苷對照品(批號20160523)、天麻素對照品(批號20161217)、對羥基苯甲醇對照品(批號20160317)和對羥基苯甲醛對照品(批號20160415) 均購于上海金穗生物科技有限公司,純度均>98.0%;乙腈和甲醇為色譜純 美國Tedia公司;PE20(20 μm)保鮮膜和精準控溫保鮮庫(±0.5 ℃) 均來自于國家農產品保鮮工程技術研究中心(天津)。

TA.XT.Plus質構儀 英國SMS公司;UV-2550型紫外分光光度計 日本Shimazhu公司;pHS-25型數顯酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司;PAL-1型迷你數顯折射計 日本ATAGO;Check PiontⅡ便攜式殘氧儀 丹麥Dansensor公司;CR400-色差儀 日本柯尼卡美能達;DH5000BII電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司;Microfug?20R centrifuge高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;T100TMThermal Cycler PCR儀 美國伯樂有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀和AUW120D型電子分析天平 均來自于日本島津公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 安捷倫科技(中國)有限公司;KQ-5200DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RC-4型精創溫度記錄儀 江蘇省精創電氣股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 處理方法 2017年12月25日在貴州省畢節市大方縣烏蒙騰菌業有限公司基地對烏天麻進行采挖,將采挖好的烏天麻立即運回貴州省果品加工工程技術研究中心果蔬貯藏與保鮮研究室。選擇大小基本一致、無病蟲害、無機械損傷的天麻,將選好的天麻經20 μm的PE保鮮膜分裝(2.5 kg/袋),每組設3個重復,其中10組擺放于保鮮庫內(1±0.5) ℃、另外10組擺放于實驗室恒溫培養箱內(25±0.5) ℃,每3 d分別對天麻的生理品質及酶活性進行測定,測定周期為30 d,并在貯藏30 d時對腐爛天麻進行病原菌的分離純化與鑒定。

1.2.2 采后指標測定方法

1.2.2.1 冰點 隨機挑選剛挖的天麻,取不同大小、無機械損傷的10個天麻,稱取單果質量后,將精創溫度記錄儀探頭從橫徑最大處插到天麻中央,之后將連有溫度探頭的天麻置于低溫冰箱(-18 ℃)凍結,果心溫度每1 min自動記錄1次。待溫度恒定,將數據傳入計算機,制作凍結曲線,確定天麻的冰點。

1.2.2.2 腐爛率 以表面變黑或長霉記作腐爛天麻,采用計數法測定天麻的腐爛率,計算公式如下:

腐爛率(%)=腐爛個數天麻/天麻總個數×100

1.2.2.3 硬度 天麻硬度采用英國TA.XT.Plus物性測定儀測定,利用P/2柱頭(Φ2 mm)對其進行穿刺測試,測試參數:穿刺深度為10 mm,測前速度為2 mm/s,測試速度為1 mm/s,測后速度為2 mm/s。

1.2.2.4 含水量 將天麻切成厚度為1 cm的薄片,稱取質量為(5±0.2) g左右的天麻片,在恒溫干燥箱中烘12 h,溫度為65 ℃,冷卻后稱量。計算公式如下:含水量(%)=(烘前試樣質量-烘后試樣質量)/烘前試樣質量×100。

1.2.2.5 呼吸強度 呼吸強度的測定均參照張鵬等[10]報道的方法進行測定。

1.2.2.6 色差 采用色差儀進行測定。L*值越大則天麻越亮,L*值越小則天麻越暗(每處理組隨機取12個天麻對天麻外表正中部位進行測定,記作為色差外;然后將天麻沿正中部位橫切,測量橫斷面的色差,記為色差內)。

1.2.2.7 可溶性固形物 隨機取10個天麻,將天麻切成細小顆粒后混勻,使用PAL-1迷你數顯折射儀進行測定,共測定10次。

1.2.2.8 蛋白質 蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法[11]測定天麻中的蛋白質。

1.2.2.9 多糖 多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[12]來測定天麻中的多糖。

1.2.2.10 天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇 參照閆寶慶等[13]研究的方法,采用HPLC方法同時測定天麻中天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇的含量,有改動。采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相乙腈-0.05%磷酸,梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;檢測波長270 nm。

1.2.2.11 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 SOD活性測定參考曹建康等[14]果蔬采后生理生化實驗指導書的方法進行測定(規定0.01 A/min=1U)。

1.2.2.12 多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性測定 POD活性測定采用愈創木酚法,PPO活測定采用鄰苯二酚法,均參照張群等[15]測定方法。

1.2.2.13 過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定 參照張亞偉等[16]測定方法對天麻過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性進行測定。

1.2.2.14 天麻致病菌的鑒定 天麻致病菌的鑒定方法參照郜海燕等[17]測定方法,有改動,具體如下:

病原菌的分離純化:腐爛天麻依次用無菌水清洗、0.1%升汞表面消毒3 min、75%乙醇擦拭消毒后,無菌濾紙上吸干水份,置于超凈工作臺吹干待用。用無菌剪刀剪去腐爛天麻病斑表皮,于病健交界部位取少量天麻組織接種于PDA平板上,置于25 ℃恒溫培養箱中培養。2 d后,用接種針挑取菌落邊緣的菌絲接種于新的PDA 培養基上,純化3～4次后使用。

rDNA-ITS 序列擴增:按照上海生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(CAS B518259)進行病原菌基因組DNA提取,以基因組DNA為模板,使用rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′)進行PCR擴增。20 μL反應體系:2×Taq Master Mix 10 μL、DNA模板1 μL、ITS1和ITS4引物各1 μL,ddH2O補足至20 μL。反應程序為:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30 個循環;72 ℃終延伸10 min。

序列分析:PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果利用NCBI(National Center for Biotechnology Information 美國國家生物技術信息中心)的多序列比對工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool 堿基局部對準檢索工具)在序列數據庫GenBank中作同源性相似差異性分析,下載同源性較高的序列,使用最大似然法(MI)分析親緣關系。MI分析采用MEGA7進行,bootstrap重復值1500、選用Kimura 2-parameter model、得到系統發育樹后使用iTOL v4在線軟件進行整理,最后將病原菌的親緣分析結果對其進行鑒定。

1.2.2.15 天麻生理品質相關性分析和主成分分析 通過SPSS19.0軟件將天麻17個生理品質(硬度、呼吸強度、含水量、色差外、色差內、可溶性固形物、蛋白質、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、SOD、PPO、POD、CAT、APX)的相關指標進行相關性分析和主成分分析。

1.3 數據處理與分析

采用Origin Pro 2017軟件對數據進行統計處理,采用SPSS 19.0軟件的Duncan氏新復極差法進行數據差異顯著性分析,及用相關性分析和主成分分析法分析各樣品生理品質的變化(P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著)。

2 結果與分析

2.1 天麻的冰點

研究表明,農產品在冰點以下貯藏易導致冷害,嚴重甚至導致凍害[18]。圖1表明,放入低溫環境后的天麻溫度持續降低至-0.3 ℃出現拐點,并且在此溫度下持續4 min,這主要是由于在相變的時候會釋放熱量[17],因此,推斷天麻的冰點為-0.3 ℃,考慮到冰箱溫度波動及冷庫溫度波動等原因,為了避免冷害,建議天麻冷藏溫度為0～1 ℃。

圖1 天麻的凍結曲線Fig.1 The freezing curve of Gastrodia elata

2.2 鮮天麻貯藏期生理品質的變化

2.2.1 腐爛率 腐爛率是農產品貯藏期重要的變化指標之一,它直接影響農產品的價值。圖2表明,在0～3 d時,25和1 ℃貯藏的天麻均沒有出現腐爛,從3 d開始,25 ℃貯藏的天麻出現腐爛,而1 ℃貯藏的天麻從9 d開始出現腐爛。25 ℃貯藏21 d時,天麻的腐爛率為19.76%,并且天麻腐爛率開始快速上升,而1 ℃貯藏的天麻腐爛率從21 d開始逐漸緩慢上升。在30 d時,25 ℃貯藏天麻的腐爛率高達45.38%,而1 ℃貯藏的天麻腐爛率僅為14.48%,并且從貯藏18 d開始至貯藏30 d,1 ℃貯藏的天麻腐爛率均顯著低于25 ℃的貯藏天麻(P<0.05)。說明1 ℃貯藏能夠降低天麻的腐爛率。

圖2 鮮天麻貯藏期腐爛率的變化Fig.2 Changes of the rot ratio of Gastrodia elata during storage

2.2.2 硬度 硬度值的變化能直接反映出農產品的軟化程度,進而衡量農產品的新鮮程度。圖3表明采挖時新鮮天麻的硬度為1468.22 g,在貯藏期前9 d時,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻硬度沒有顯著性差異(P>0.05),從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏的天麻硬度顯著低于1 ℃貯藏的天麻(P<0.05)。在整個貯藏期,1 ℃貯藏天麻硬度的變化沒有顯著性差異(P>0.05),硬度值在1468.22～1306.82 g范圍內波動,沒有顯著性變化(P>0.05)。25 ℃貯藏的天麻從12 d開始快速下降,貯藏30 d時,25 ℃貯藏的天麻硬度僅為1113.32 g。說明天麻從貯藏期12 d開始,1 ℃貯藏天麻可延緩其硬度的降低,而25 ℃貯藏的天麻從12 d開始快速下降,在貯藏30 d時極顯著(P<0.01)低于采挖時天麻硬度值。

圖3 鮮天麻貯藏期硬度的變化Fig.3 Changes of the firmness of Gastrodia elata during storage

2.2.3 含水量 含水量可以判斷農產品的新鮮度。圖4表明,剛采挖的天麻含水量為81.91%,在前6 d,不同溫度下的天麻含水量沒有顯著性差異(P>0.05),從貯藏9 d開始,25 ℃貯藏的天麻含水量開始快速下降,而1 ℃貯藏的天麻含水量下降緩慢,在貯藏30 d時,1 ℃貯藏的天麻含水量71.88%,而25 ℃貯藏的天麻含水量僅為61.69%。說明天麻的含水量隨著貯藏期間的延長開始呈現下降的趨勢,并且1 ℃有利于減緩天麻含水量的下降,主要因為低溫降低了天麻的呼吸強度,從而減緩了水分的流失,這與郭園園等[19]研究不同貯藏溫度對青皮核桃保鮮的影響結果一致。

圖4 鮮天麻貯藏期含水量的變化Fig.4 Changes of the water content of Gastrodia elata during storage

2.2.4 呼吸強度 呼吸強度是可以評價農產品的生命活動的關鍵指標之一,通過呼吸強度可以判斷農產品營養物質的消耗情況以及衰老情況[19]。圖5表明,貯藏期0～3 d的天麻呼吸強度很低,可能由于天麻處于休眠期。從貯藏6 d開始,25 ℃貯藏天麻的呼吸強度開始快速上升,而1 ℃貯藏天麻的呼吸強度緩慢上升,并且從貯藏6 d開始至貯藏30 d內,25 ℃貯藏天麻的呼吸強度顯著高于1 ℃貯藏天麻的呼吸強度(P<0.05)。在貯藏15 d時,25 ℃貯藏天麻的呼吸強度達到呼吸高峰,而1 ℃貯藏天麻的呼吸強度在24 d達到呼吸高峰。由此推測,天麻的呼吸類型屬于躍變型呼吸,并且1 ℃貯藏能夠抑制天麻呼吸強度。

圖5 鮮天麻貯藏期呼吸強度的變化Fig.5 Changes of the respiration rate of Gastrodia elata during storage

2.2.5 色差 色差L*值反映天麻顏色的亮度,L*值越大,代表天麻的亮度越大,在貯藏期間天麻的褐變情況影響天麻的L*值。圖6(A)表明,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻外表色差L*值在貯藏21 d內均沒有顯著性變化(P>0.05),從貯藏21 d開始快速下降,在貯藏30 d時,1 ℃貯藏的天麻外表色差L*值極顯著(P<0.01)高于25 ℃貯藏天麻的L*值。圖6(B)表明,25和1 ℃貯藏的天麻內部色差L*值在貯藏12 d內均沒有顯著性變化(P>0.05),從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏天麻的L*值開始下降,并且從貯藏12 d開始至貯藏30 d,1 ℃貯藏的天麻內部色差L*值顯著高于25 ℃貯藏天麻的L*值(P<0.05)。由此推測,天麻的褐變從內部開始逐漸向外褐變,并且1 ℃的貯藏能夠延緩天麻的褐變。

圖6 鮮天麻貯藏期色差的變化Fig.6 Changes of the chromatic aberration of Gastrodia elata during storage

2.3 鮮天麻貯藏期營養品質的變化

2.3.1 可溶性固形物含量 可溶性固形物含量變化是農產品貯藏期間重要的指標之一,通常情況下,農產品會因自身新陳代謝消耗而使可溶性固形物含量下降,這與圖7的結果一致。圖7表明,剛采挖的天麻可溶性固形物含量為6.73%,隨著貯藏時間的延長,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻分別呈現不同程度的下降,并且在整個貯藏期間,兩處理組沒有顯著性差異(P>0.05),但從貯藏24 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏的天麻可溶性固形物含量高于1 ℃貯藏的天麻。說明天麻的可溶性固形物含量隨貯藏時間的延長呈現下降趨勢,并且25 ℃和1 ℃貯藏的天麻對其可溶性固形物含量的影響沒有顯著差異(P>0.05)。

圖7 鮮天麻貯藏期可溶性固形物含量的變化Fig.7 Changes of the soluble solids content of Gastrodia elata during storage

2.3.2 蛋白質含量和多糖含量 天麻蛋白質是天麻重要的營養指標之一,天麻多糖具有調節機體免疫力、降血壓、抗衰老等多種功能[20]。圖8(A)表明,天麻的蛋白質含量總體呈現下降的趨勢,在整個貯藏期間,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻蛋白質含量沒有顯著差異,但從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏的天麻蛋白質含量低于1 ℃的貯藏。圖8(B)表明,剛采挖的天麻多糖含量為273.45 mg·g-1,從貯藏開始至貯藏12 d,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻多糖含量沒有顯著性差異(P>0.05)。從貯藏15 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏的天麻多糖含量顯著低于1 ℃的貯藏(P<0.05)。因此,天麻的多糖含量呈現下降的趨勢,并且1 ℃的貯藏能夠保持天麻的多糖含量。

圖8 鮮天麻貯藏期蛋白質含量(A)和多糖含量(B)的變化Fig.8 Changes of the content of protein(A) and polysaccharidet(B)of Gastrodia elata during storage

2.3.3 天麻素含量和腺苷含量 目前的研究認為天麻素是天麻的主要活性成分,是評價天麻質量標準的首要指標,天麻腺苷具有鎮靜、催眠等作用[21]。圖9(A)表明,剛采挖天麻的天麻素含量為685.45 μg·g-1,在貯藏期前3 d,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻的天麻素含量沒有顯著性差異(P>0.05)。從貯藏3 d開始,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量開始快速下降,并且從貯藏3 d至貯藏30 d,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量低于1 ℃的貯藏,在貨架30 d時,1 ℃貯藏天麻的天麻素含量為632.46 μg·g-1,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量603.32 μg·g-1。圖9(B)表明,剛采挖天麻的腺苷含量為97.22 μg·g-1,在整個貯藏期內,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻的腺苷含量沒有顯著性差異(P>0.05)。在貯藏30 d時,25 ℃和1 ℃貯藏天麻的腺苷含量分別為71.32、76.48 μg·g-1。說明天麻的天麻素含量和腺苷含量在貯藏期間均呈現下降的趨勢,并且相較于天麻腺苷,溫度對天麻素的含量變化影響更大。

圖9 鮮天麻貯藏期天麻素含量(A)和腺苷含量(B)的變化Fig.9 Changes of the gastrodin(A)and adenosine(B) content of Gastrodia elata during storage

2.3.4 對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛含量 對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛也是天麻重要的活性成分,具有良好的保健功能[22]。圖10(A)表明,天麻的對羥基苯甲醇含量呈現下降的趨勢,并且從貯藏6 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量低于1 ℃貯藏的天麻,貯藏30 d時,25 ℃和1 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量分別為173.32、186.82 μg·g-1。圖10(B)表明,天麻的對羥基苯甲醛含量變化與對羥基苯甲醇含量變化相似。采挖的天麻對羥基苯甲醛含量為7.75 μg·g-1,貯藏30 d時,25 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量顯著低于1 ℃貯藏(P<0.05)。說明低溫能夠延緩天麻對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛含量的下降。

圖10 鮮天麻貯藏期對羥基苯甲醇含量(A)和對羥基苯甲醛含量(B)的變化Fig.10 Changes of the p-hydroxybenzyl alcohol(A) and p-hydroxyben zaldehyde(B) content of Gastrodia elata during storage

2.4 鮮天麻貯藏期酶活性的變化

2.4.1 超氧化物歧化酶(SOD) 超氧化物歧化酶(SOD)能夠專一性地清除農產品組織內的超氧化物,將超氧化物歧化過氧化氫酶和氧氣,預防農產品組織衰老。圖11表明,剛采挖的天麻SOD活性為419.26 U·g-1,在整個貯藏期內,25 ℃貯藏天麻的SOD活性低于1 ℃貯藏天麻的SOD活性,貯藏30 d時,25 ℃和1 ℃貯藏天麻的SOD活性與采挖時天麻SOD活性比較,分別下降了3.79%和1.32%,但均沒有顯著差異(P>0.05),說明天麻SOD活性在整個貯藏期處于波動狀態,低溫能夠延緩SOD活性的下降。

圖11 鮮天麻貯藏期超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig.11 Changes the superoxide dismutase activity of Gastrodia elata during storage

2.4.2 多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD) 多酚氧化酶(PPO)能夠催化酚類生成醌類的一種氧化酶,當農產品組織受到逆境脅迫或病菌侵染時,PPO活性會快速上升來保護其組織。圖12(A)表明,PPO活性隨著貯藏時間呈現先上升后下降繼續上升的趨勢,從貯藏開始至貯藏9 d時,25 ℃和1 ℃貯藏天麻的PPO活性均呈現上升趨勢,有可能由于剛采挖的天麻需要克服新的環境而導致PPO活性上升,而1 ℃貯藏天麻PPO活性上升快主要由于低溫脅迫加速PPO活性快速上升。隨著貯藏期間的延長，天麻開始適應貯藏環境,PPO活性開始降低。而天麻PPO活性再一次上升是由于貯藏期間的天麻開始出現衰老,甚至病菌的浸染。從貯藏21 d開始至貯藏30 d,25 ℃天麻的PPO活性低于1 ℃貯藏的天麻活性。POD能夠清除農產品體內的H2O2,把H2O2分解成對細胞沒有傷害的H2O和O2,它也是農產品衰老的重要指標之一。圖12(B)表明,從貯藏開始至貯藏6 d,25 ℃貯藏天麻的POD呈現下降趨勢,而1 ℃貯藏天麻的POD活性呈現上升趨勢,這可能是由于低溫脅迫導致的,這與圖12(A)PPO活性貯藏前期結果相似。在貯藏18 d時,25 ℃貯藏的天麻POD活性達到波峰,而1 ℃貯藏的天麻POD活性在24 d時出現波峰。在貯藏30 d時,1 ℃貯藏天麻的POD活性顯著高于25 ℃貯藏天麻的POD活性(P<0.05)。因此,低溫脅迫導致天麻PPO活性和POD活性的上升,但隨著貯藏期的延長,低溫延緩了天麻PPO活性和POD活性的上升。

圖12 鮮天麻貯藏期多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性的變化Fig.12 Changes of the polyphenol oxidase activity(A) and the peroxidase activity(B)of Gastrodia elata during storage

2.4.3 過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX) CAT能夠在逆境或者植物衰老過程中清除體內多余的活性氧,來維持體內氧代謝平衡,從而抑制其自身的衰老。圖13(A)表明,在貯藏期前6 d,天麻的CAT活性呈現下降的趨勢,并且1 ℃貯藏的天麻CAT活性下降更快,說明采挖后天麻由于適宜新環境加快呼吸,導致體內產生多余的活性氧從而使其CAT活性下降,并且低溫脅迫加速了天麻CAT活性的下降。從貯藏9 d開始至貯藏30 d時,25 ℃貯藏的天麻CAT活性顯著(P<0.05)低于1 ℃貯藏的天麻CAT活性。抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性是植物體內抗氧化酶之一,其活性與植物體抗氧化水平呈正比。圖13(B)表明,剛采挖的天麻APX活性為19.10 U·g-1,從貯藏開始至貯藏結束,1 ℃貯藏天麻的APX活性高于25 ℃貯藏天麻的APX活性,在整個貯藏期天麻APX活性均處于上升與下降的“波動”狀態,這可能由于天麻受低溫脅迫和其氧化衰老相關。因此,1 ℃貯藏能夠保持天麻較高的抗氧化活性,并且整個貯藏期天麻的APX活性呈現“波動”狀態。

圖13 鮮天麻貯藏期過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化Fig.13 Changes of the catalase activity(A)and the ascorbic acid peroxidase activity(B)of Gastrodia elata during storage

2.5 天麻貯藏期病原菌rDNA-ITS區域核苷酸序列測定與分析

以病原菌基因組DNA為模板進行PCR擴增,得到500～550 bp的rDNA-ITS片段,將測序得到的4個rDNA-ITS基因序列提交到GeneBank,獲得登錄號分別為MK141012、MK141013、MK141014和MK141015;上述序列于GenBank數據庫進行BLAST 同源性比對,下載同源性超過90%的基因序列構建系統發育樹如圖14所示。結果顯示,菌株A位于新殼梭孢菌屬(Neofusicoccumsp.);菌株B位于間座殼屬(Diaporthesp.);菌株C位于鏈格孢屬(Alternariasp.);菌株D位于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)。因此,可確定天麻病原菌主要為新殼梭孢菌屬、間座殼屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬,所有菌株均為該菌屬新的菌種。

圖14 基于rDNA-ITS序列的天麻病原菌系統發育樹Fig.14 Phylogenetic tree of the pathogen of Gastrodia elata and related species based on rDNA-ITS sequences

2.6 相關性分析與主成分分析

2.6.1 天麻生理品質相關性分析 表1表明,硬度分別與呼吸強度、含水量、內部色差、可溶性固形物、蛋白質、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇呈極顯著相關(r=-0.844～0.862,P<0.01),而與SOD呈顯著正相關(r=0.530,P<0.05);外部色差與內部色差、可溶性固形物、蛋白質、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇呈極顯著正相關(r=0.570～0.746,P<0.01),與對羥基苯甲醛呈顯著相關(r=0.533,P<0.05);呼吸強度、含水量、內部色差與天麻營養指標均呈現極顯著相關(P<0.01),天麻營養指標相互之間均呈現極顯著正相關(r=0.873～0.975,P<0.01);SOD與呼吸強度呈顯著負相關(r=-0.719,P<0.05);PPO與可溶性固形物、蛋白質、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇呈極顯著負相關(r=-0.647～-0.567,P<0.01),

表1 天麻生理品質相關性分析Table 1 The correlation analysis of physiological quality of Gastrodia elata

與對羥基苯甲醛呈顯著負相關(r=-0.486,P<0.05);POD與外部色差和SOD呈顯著正相關(P<0.05);CAT與含水量和內部色差呈顯著正相關(P<0.05);APX與其他指標均呈現不顯著相關(P>0.05)。

2.6.2 天麻生理品質主成分分析 表2和表3表明,前三個主成分的貢獻率為84.587%,說明可以用這3個主成分較好地代替上述17生理品質指標來評價天麻的生理品質變化規律。決定第一主成分的主要是硬度、呼吸強度、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等性狀,第一主成分反映了原始數據信息量的62.575%,這幾個指標均屬于天麻的生理和營養品質。因此,可以把第一主成分稱為生理營養因子。決定第二主成分大小的主要為SOD、PPO、POD、CAT、APX,其貢獻率為13.307%,其中這幾個指標均屬于天麻的酶活性。所以可以把第二主成分稱為酶活性因子。決定第三主成分的是外部色差,其貢獻率為8.706%,稱其為外部色差因子。

表2 總方差解釋Table 2 Total variance explained

表3 成分矩陣Table 3 Component matrix

用三個主成分對天麻質地進行綜合評價并計算綜合得分[23]。以F1、F2、F3做線性組合,并以每個主成分的方差貢獻率作為權數建立綜合評價函數:F=(62.575% F1+13.307% F2+8.706% F3)/84.587%,其中F1:第一主成分得分,F2:第二主成分得分,F3:第三主成分得分,F為綜合得分,F得分越高,說明生理品質越好。

3 結論

綜上分析,通過研究鮮天麻采后貯藏期生理品質變化規律,結果表明,低溫(1±0.5) ℃能夠延緩鮮天麻采后的生理品質變化,建議天麻冷藏溫度為0～1 ℃。天麻貯藏期主要的病原菌為新殼梭孢菌、間座殼屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬。相關性分析表明,鮮天麻采后生理品質均呈現良好的相關性,并且天麻的營養指標相互之間均呈現極顯著正相關(P<0.01)。另外,通過主成分分析建立了天麻品質的綜合評價函數,用于對天麻貯藏品質變化進行評價。