葛仙米藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的體外抗炎和抗紫外活性比較研究

余 佳,張瑞華,王 生,許文琦,王玉蘭,*

(1.湖南炎帝生物工程有限公司,湖南省微藻生物工程技術(shù)研究中心,湖南株洲 412007; 2.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)研究總院,上海 200040; 3.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院創(chuàng)新藥物與制藥工藝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200437)

3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)是一種黃顏色的染料,活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能夠代謝還原MTT,同時(shí)在細(xì)胞色素C的作用下,生成藍(lán)色(或藍(lán)紫色)不溶于水的甲臜(Formazan),甲臜的多少可以用酶標(biāo)儀在570 nm 處進(jìn)行測(cè)定。在通常情況下,甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)成正比,因此可根據(jù)光密度OD570的值推測(cè)出活細(xì)胞的數(shù)目,從而判斷其對(duì)細(xì)胞的影響。脂多糖LPS作用于細(xì)胞后,在LPS輔助蛋白和CD14的輔助下啟動(dòng)TLR4信號(hào)通路,激活下游的MAPK和NF-κB信號(hào)通路,促進(jìn)炎癥基因的轉(zhuǎn)錄分泌釋放炎癥因子NO和TNF-α[1]。炎癥因子的過(guò)度釋放是多種疾病的發(fā)生發(fā)展的重要原因,包括急性的膿毒血癥、急性肺損傷以及慢性的動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病和肥胖等[2]。目前臨床上除了抗生素,尚缺乏有效的抗炎藥物[3]。

葛仙米(NostocsphaeroidsKutzing),學(xué)名球狀念珠藻,屬藍(lán)藻門[4](Nostocaceae)念珠藻屬(Nostoc)[5-9],是一種藥食同源的經(jīng)濟(jì)藍(lán)藻。葛仙米鮮品富含7%～8%的藻膽蛋白,主要為藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白,其中藻藍(lán)蛋白是藻紅蛋白的3.5倍左右[10];在野生葛仙米干品中,總蛋白含量高達(dá)50%以上,含有17種氨基酸,其中8種人體必需氨基酸含量達(dá)44.6%[11]。野生葛仙米還富含藻多糖、礦物質(zhì)和不飽和脂肪酸,是一種理想的健康食品[12]。在我國(guó)古代就有其歷史記載,《藥性考》中稱葛仙米具有“清神解熱,痰火能療”的作用,《綱目拾遺》中則記載葛仙米能“解熱,清膈,利腸胃”,《陜西中草藥》稱其在“清熱收斂,益氣明目,治燙火傷,夜盲癥”有很好的功效[13]。野生葛仙米較為罕見,早年主要分布在湖北鶴峰、湖南張家界等少數(shù)地區(qū)的農(nóng)田中,但由于農(nóng)藥的濫用,野生葛仙米大量減產(chǎn),已瀕臨滅絕[14-15]。現(xiàn)在市場(chǎng)上主要為人工養(yǎng)殖的葛仙米,其干品蛋白質(zhì)的含量不如野生葛仙米豐富,約在32%以上[16]。人工養(yǎng)殖的葛仙米于2018年被國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批復(fù)可作為新食品原料使用。

現(xiàn)代研究表明,葛仙米蛋白具有較好的調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外損傷、抗腫瘤等功能[17]。在抗炎方面,Romay等[18]在12種炎癥模型中發(fā)現(xiàn)藻藍(lán)蛋白表現(xiàn)出劑量依賴的抗炎作用,可能會(huì)減少組胺釋放、減輕髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性及前列腺素E2的水平,而對(duì)于藻紅蛋白的抗炎作用目前研究還很少。在抗紫外損傷方面,有研究顯示,藻膽蛋白對(duì)小鼠NIH 3T3成纖維細(xì)胞具有顯著的促增殖作用,并對(duì)UVA輻射損傷的小鼠NIH 3T3成纖維細(xì)胞具有修復(fù)作用[19],而對(duì)于藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的抗紫外損傷作用研究甚少。由人工養(yǎng)殖的葛仙米提取純化得到的藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白的抗炎活性和抗紫外活性的比較研究更是鮮有報(bào)道。

本文通過(guò)考察藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW264.7)細(xì)胞增殖及分泌NO和TNF-α的影響,研究了其抗炎的活性,并通過(guò)MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)方法考察藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白抗UVB輻照誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞紫外損傷,為人工養(yǎng)殖的葛仙米的精細(xì)深加工及藥用開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛仙米藻紅蛋白母液(純度為95%)、葛仙米藻藍(lán)蛋白母液(純度為97%) 由湖南炎帝生物工程有限公司提供的葛仙米經(jīng)反復(fù)凍融法提取出藻膽蛋白,經(jīng)過(guò)濃縮凍干,采用離子交換樹脂法分離純化蛋白,經(jīng)過(guò)凝膠過(guò)濾色譜檢測(cè),分別得到純度為95%的藻紅蛋白和97%的藻藍(lán)蛋白,用PBS于-80 ℃保存[13];脂多糖(LPS)、MTT Sigma-Aldrich公司;Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture(DMEM)高糖培養(yǎng)基、PBS和0.25%胰酶(活性為103U/mg) Corning公司;胎牛血清 Hyclone公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;小鼠成纖維細(xì)胞NIH-3T3、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 實(shí)驗(yàn)室凍存細(xì)胞,來(lái)源于 ATCC 細(xì)胞庫(kù);NO檢測(cè)試劑盒 北京普利萊基因技術(shù)有限公司;小鼠TNF-αElisa檢測(cè)試劑盒 Cusabio公司。

FORMA 371 STERI-CYCL細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱、Varioskan Flash酶標(biāo)儀 賽默飛世爾科技公司;SH4B紫外光療儀 上海希格瑪高技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 抗炎活性考察

1.2.1.1 考察藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于96孔板中,1×104個(gè)/孔,每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入135 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后,每孔分別加入不同濃度受試樣品(受試蛋白樣品濃度設(shè)為0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL,配制方法為將母液解凍后用3220×g離心5 min,上層液過(guò)0.22 μm濾膜除菌,然后分裝,用PBS稀釋不同濃度梯度,用完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋)15 μL,對(duì)照組加入15 μL PBS緩沖液,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后加入三聯(lián)裂解液,每孔100 μL,于37 ℃過(guò)夜后,酶標(biāo)儀檢測(cè)在570 nm處的吸光率,依照公式:OD570=log(A/B),A為儀器給出的特定波長(zhǎng)的光強(qiáng),B為經(jīng)檢測(cè)后該特定波長(zhǎng)的光強(qiáng),計(jì)算出OD570的值,并以此進(jìn)行圖形分析。

1.2.1.2 對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞釋放NO和TNF-α的影響 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于96孔板中,1×104個(gè)/孔,每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入162 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后,除對(duì)照孔外,每孔加入18 μL LPS(1 μg/mL),同時(shí)每孔分別加入(受試蛋白樣品濃度預(yù)設(shè)為0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL)20 μL,模型組加入20 μL PBS緩沖液。

對(duì)照組與模型組相比,LPS替換為18 μL的PBS緩沖液。孵育24 h后收集細(xì)胞上清液,按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞上清中NO和TNF-α的含量。

1.2.2 抗紫外活性考察

1.2.2.1 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞(NIH-3T3)細(xì)胞增殖的影響 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH-3T3細(xì)胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于96孔板中,1×104個(gè)/孔,每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入135 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后,每孔分別加入不同濃度受試樣品(受試蛋白樣品濃度預(yù)設(shè)為0.01、0.1、1、10、100 μg/mL)15 μL,孵育24 h后,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后加入三聯(lián)裂解液,每孔100 μL,于37 ℃過(guò)夜后,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570。

1.2.2.2 UVB誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞損傷模型建立 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH-3T3細(xì)胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于96孔板中,1×104個(gè)/孔,每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入135 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后,進(jìn)行紫外輻照處理,實(shí)驗(yàn)用UVB波長(zhǎng)311 nm,輻照強(qiáng)度13 mW/cm2,細(xì)胞距輻照光源11 cm,輻照劑量設(shè)置為100、500、1000、2000、4000 mJ/cm2,孵育后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后加入三聯(lián)裂解液,每孔100 μL,于37 ℃過(guò)夜后,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570。

1.2.2.3 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)UVB誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞損傷的影響 用含10% FBS、1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)NIH-3T3細(xì)胞,胰酶(含1 mmol/L EDTA)消化細(xì)胞、計(jì)數(shù)、細(xì)胞鋪于96孔板中,1×104個(gè)/孔,每組4個(gè)復(fù)孔。每孔加入135 μL細(xì)胞懸液,每組4個(gè)復(fù)孔。24 h后,進(jìn)行紫外輻照處理,實(shí)驗(yàn)用UVB波長(zhǎng)311 nm,輻照強(qiáng)度13 mW/cm2,細(xì)胞距輻照光源11 cm,輻照劑量設(shè)置為4000 mJ/cm2,輻照完成后立即加入不同濃度受試樣品(受試蛋白樣品濃度預(yù)設(shè)為0.01、0.1、1、10 μg/mL),孵育后繼續(xù)培養(yǎng)24 h,每孔加入MTT溶液20 μL(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h,然后加入三聯(lián)裂解液,每孔100 μL,于37 ℃過(guò)夜后,酶標(biāo)儀檢測(cè)OD570。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)以Mean±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗炎活性考察

2.1.1 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7孵育24 h,藻藍(lán)蛋白100 μg/mL顯著抑制RAW264.7細(xì)胞增殖(P<0.05),藻紅蛋白100 μg/mL極顯著抑制RAW264.7細(xì)胞增殖(P<0.01)(見圖1)。因此后續(xù)的研究選用劑量為0.001～10 μg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響(n=4),Fig.1 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on RAW264.7 cell proliferation(n=4)注:*代表與對(duì)照組相比差異顯著,P<0.05;**代表與對(duì)照組相比差異極顯著,P<0.01。

2.1.2 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌NO和TNF-α的影響 如圖2,與對(duì)照組相比,給予LPS(1 μg/mL)刺激后,RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO和TNF-α的量顯著升高(P<0.01),

圖2 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響(n=4)Fig.2 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on NO release from RAW264.7 cells(n=4)注:*代表與模型組相比差異顯著,P<0.05，**極顯著，P<0.01; #代表與對(duì)照組相比差異顯著,P<0.05,##極顯著,P<0.01;圖3、圖4、圖6同。

表明細(xì)胞刺激模型建立成功。結(jié)果顯示藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白都有一定的抑制RAW264.7細(xì)胞分泌NO和TNF-α的能力,并且其抑制能力都呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。藻藍(lán)蛋白1、10 μg/mL與模型組相比能顯著降低NO水平(P<0.01),藻紅蛋白0.1、1、10 μg/mL也能顯著降低NO水平(P<0.01)。

如圖3,藻藍(lán)蛋白0.001、0.01、0.1、1、10 μg/mL均能極顯著降低TNF-α的水平(P<0.01),藻紅蛋白0.01、0.1、1、10 μg/mL四個(gè)濃度可以極顯著降低TNF-α水平(P<0.01)(見圖3)。藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7分泌的NO和TNF-α的水平(P<0.01),且呈現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。藻紅蛋白在抑制RAW264.7細(xì)胞分泌NO的作用強(qiáng)于藻藍(lán)蛋白,而藻藍(lán)蛋白對(duì)TNF-α的分泌抑制作用強(qiáng)于藻紅蛋白。

圖3 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放TNF-α的影響(mean±SD,n=4),Fig.3 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on TNF-α release from RAW264.7 cells(mean±SD,n=4)

人工養(yǎng)殖的葛仙米藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白具有明顯的抗炎活性,其藻紅蛋白主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)為主,β-折疊結(jié)構(gòu)含量較少,主要以顆粒狀不均勻分布或棒狀形式分布[20],藻藍(lán)蛋白含有極大螺旋藻α鏈,中性環(huán)境呈鏈狀,聚集態(tài)主要為片層、針狀和蜂窩狀形式[21]。兩種蛋白的結(jié)構(gòu)有較大的不同,其對(duì)于抗炎的作用機(jī)理也不相同。藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白可以抑制 TNF-α和NO炎癥因子的分泌,它們對(duì)多種活性自由基有清除能力[10],阻斷了炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵靶點(diǎn),促進(jìn)了其抗炎活性。同時(shí),它們可能通過(guò)抑制細(xì)胞核內(nèi) TNF-α和NO基因的表達(dá),進(jìn)而抑制NF-κB或NO等炎癥信號(hào)通路發(fā)揮抗炎活性[18]。

2.2 抗紫外活性考察

2.2.1 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)NIH-3T3細(xì)胞增殖的影響 如圖4所示,藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白在100 μg/mL濃度時(shí)對(duì)NIH-3T3細(xì)胞增殖有極顯著抑制作用(P<0.01),其他濃度對(duì)NIH-3T3細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。因此后續(xù)的研究選用劑量為0.001～10 μg/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖4 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)NIH-3T3細(xì)胞增殖的影響(n=4)Fig.4 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on NIH-3T3 cell proliferation(n=4)

2.2.2 UVB誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞損傷模型建立 紫外輻射不僅改變細(xì)胞形態(tài),對(duì)細(xì)胞的活性也有影響。建立UVB誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞的紫外損傷模型,如圖5所示,UVB 2000、4000 mJ/cm2輻照劑量可以誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞明顯的細(xì)胞毒作用,造成NIH-3T3細(xì)胞的損傷,本實(shí)驗(yàn)采用4000 mJ/cm2輻照劑量。

圖5 UVB不同輻照劑量對(duì)NIH-3T3細(xì)胞的損傷作用(mean±SD,n=4)Fig.5 Effects of UVB irradiation on damage of NIH-3T3 cells(mean±SD,n=4),注:*代表與對(duì)照組相比差異顯著,P<0.05, **代表與對(duì)照組相比具有極顯著差異,P<0.01。

2.2.3 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)UVB誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞損傷的影響 利用建立的UVB誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞損傷模型,考察藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的抗紫外輻射活性。經(jīng)UVB輻照后的實(shí)驗(yàn)組在藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白的作用下,活細(xì)胞數(shù)并無(wú)顯著升高,表明藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白對(duì)UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞紫外損傷并無(wú)顯著的保護(hù)作用(圖6)。

圖6 藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)UVB誘導(dǎo)的NIH-3T3細(xì)胞損傷的影響(mean±SD,n=4)Fig.6 Effects of phycocyanin and phycoerythrin on UVB～induced damage of NIH-3T3 cells(mean±SD,n=4)

3 結(jié)論

葛仙米藻紅蛋白濃度為0.1、1和10 μg/mL時(shí)，抑制RAW264.7細(xì)胞分泌NO的作用明顯強(qiáng)于同濃度的藻藍(lán)蛋白,而藻藍(lán)蛋白濃度為0.001、0.01、0.1和1 μg/mL對(duì)TNF-α的分泌抑制作用則強(qiáng)于同濃度的藻紅蛋白。雖然UVB 4000 mJ/cm2可以成功誘導(dǎo)NIH-3T3細(xì)胞的紫外損傷,但是藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白對(duì)NIH-3T3細(xì)胞的紫外損傷并無(wú)明顯保護(hù)作用。藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的抗炎活性與其結(jié)構(gòu)有關(guān),但本文尚未闡明葛仙米藻藍(lán)蛋白和藻紅蛋白的抗炎靶點(diǎn)以及在動(dòng)物體內(nèi)的作用效果,在以后的研究中將深入研究。