金槍魚紅肉酶解液對小鼠抗疲勞和調節(jié)腸道菌群效果的研究

李淑凡,李 鑫,韓姣姣,蘆晨陽,*,周 君,李 曄,蘇秀榕,*,陳義方,王求娟

(1.寧波大學海洋學院,浙江寧波 315211; 2.浙江省象山縣公安司法鑒定中心DNA實驗室,浙江寧波 315700; 3.寧波今日食品有限公司,浙江寧波 315000)

金槍魚(Thunnusthynnus)屬于脊索動物門,硬骨魚綱,鱸形目,鯖科[1]。金槍魚需要不停的游動來呼吸氧氣,因此其對運動性疲勞具有較強耐受能力,含有豐富的抗疲勞活性物質。金槍魚紅肉腥味大、口感差,雖然具有豐富的蛋白質、氨基酸、多不飽和脂肪酸和礦物質元素,但是一般被作為加工副產(chǎn)物丟棄。

疲勞是機體復雜的生理生化過程,也是現(xiàn)代社會一種常見的亞健康狀態(tài)。機體長期處于疲勞狀態(tài),會對健康產(chǎn)生不良影響。一些抗疲勞物質可以起到延緩疲勞產(chǎn)生和加速疲勞消除的作用,包括多肽、多糖、苷類、萜類和黃酮類化合物等[2-4]。來源于金槍魚紅肉的多肽,是否具有抗疲勞作用,目前尚未有系統(tǒng)研究。

近年來,腸道菌群逐漸成為功效因子研究領域熱點,引起人們廣泛關注。有研究表明,腸道菌群與抗疲勞能力具有相關性,中長跑運動員腸道菌群結構與普通人差異顯著[5];而益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的補充可以有效增強機體抗疲勞能力[6]。因此,也同時研究了金槍魚紅肉酶解液對腸道菌群的影響。

本實驗以金槍魚紅肉為研究對象,利用酶解法制備紅肉酶解液并進行多肽組成和豐度的測定,隨后考察酶解液對小鼠抗疲勞和抗氧化的效果,并探究其對小鼠腸道菌群的調節(jié)作用。通過上述研究,初步明確金槍魚紅肉酶解液對小鼠的抗疲勞效果,及其對腸道菌群調節(jié)的益生元效應[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚紅肉 寧波今日食品有限公司;胰蛋白酶和堿性蛋白酶 美國Sigma公司;ICR雄性小鼠和雌性小鼠各12只 浙江省實驗動物中心(SCXK Zhejiang 2014-0001 No. 1605200003);小鼠飼料 寧波大學實驗動物中心;肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸和丙二醛(MDA)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所;TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

S2-A81型不銹鋼小型攪拌機 中國九陽股份有限公司;真空冷凍干燥機 美國LABCONCO公司;5418R型離心機 德國Eppendorf公司;5800型MALDI-TOF/TOF系統(tǒng) 美國AB SCIEX公司;YLS-4C型轉棒式疲勞儀 淮北正華生物儀器設備公司;NanoDrop 2000C 美國Thermo Fisher公司;高通量測序儀 美國Illumina公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金槍魚紅肉酶解 利用絞肉機將金槍魚紅肉絞成魚泥,隨后按照固液比1∶9稀釋金槍魚魚泥,加入3%的蛋白酶混合物(胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶2),在56 ℃下加熱攪拌4 h完成酶解。沸水浴10 min將酶失活,12000 r/min高速離心后取上清,置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h,備用。

1.2.2 酶解液多肽鑒定 將適量凍干產(chǎn)物重新溶解于60 μL甲醇水混合物(甲醇∶水=50∶50),加入終濃度為0.2%的甲酸和2 mmol/L的乙酸鈉,制成樣品溶液。將0.5 mL樣品置于MALDI板上,與2.5 mmol/L二羥苯甲酸溶液等量混合,待板上樣品于真空中干燥均勻結晶之后,利用一級質譜確定多肽分子量,利用二級質譜確定多肽氨基酸組成,獲得的數(shù)據(jù)利用MASCOT軟件與數(shù)據(jù)庫進行比對分析,確定可能的多肽結構。

1.2.3 動物飼養(yǎng) 24只8周齡ICR小鼠經(jīng)過2周的適應,分成兩組(對照組和實驗組),每組12只,雌雄各半。實驗組小鼠每天定時灌胃1次酶解液(300 mg·kg-1·d-1)[8],對照組灌胃等量生理鹽水。灌胃實驗開始時進行小鼠糞便收集和小鼠初始體重測定(0周),隨后每周末稱量體重1次,持續(xù)8周;4周末和8周末分別收集小鼠糞便,所有糞便均置于-80 ℃?zhèn)溆谩嶒炦^程中,小鼠自由攝食和飲水,控制室溫23～25 ℃,濕度50%～70%,明暗交替條件12 h/12 h。

1.2.4 體重增加量 小鼠體重增加量按照如下公式測定:

體重增加量=最終體重(8周)-初始體重(0周)。

1.2.5 轉棒能力測試 8周后,將小鼠置于轉速15 r/min的轉棒上訓練爬行,每批30 min,訓練4 d。第5日,將轉速增加到40 r/min,記錄每只小鼠的跌落時間,即為疲勞耐受時間[9]。

1.2.6 血清和肝臟中生化指標的測定 實驗結束之后,將小鼠麻醉眼球取血,4 ℃ 3000 r/min離心15 min取血清,置于-80 ℃?zhèn)溆?隨后將小鼠脫頸處死,取肝臟并去除表面血污,稱重記錄并計算肝臟系數(shù),隨后置于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｆ渲懈闻K系數(shù)按照如下公式測定肝臟系數(shù)=肝臟總質量(mg)÷體重(g)。參照試劑盒中的說明,分別對肝臟和血清中的CK、LDH、GSH-Px、SOD、LD和MDA進行測定。

1.2.6 糞便總DNA提取和腸道菌群16S rRNA測序分析 利用試劑盒提取糞便總DNA,并利用NanoDrop2000C對其質量進行檢測[10]。利用引物319F和806R對腸道菌群16S rRNA的V3和V4區(qū)進行擴增:預變性98 ℃ 30 s,35個循環(huán),每個循環(huán)包括:變性98 ℃ 10 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,最后延伸10 min[11]。瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況,合格的PCR產(chǎn)物送杭州聯(lián)川生物科技有限公司進行測序。

將有效序列中相似度超過97%的序列聚簇成同一個操作分類單元(OTUs)并進行注釋[12-13]。利用Mothur和R軟件包進行α和β多樣性分析[14]。利用冗余分析(RDA)篩選關鍵OTUs[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準偏差(means±SD)形式表示。當數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布時,利用SPSS軟件中的ANOVA和Tukey’s post-hoc進行分析;當數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時,利用MATLAB R2012a中的Mann-Whitney進行分析。當P<0.05時,即認為存在顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 金槍魚紅肉酶解液中多肽組成和豐度

在質核比0～2000范圍內,酶解液中一共檢測到403個峰,相對強度最高的10個多肽累計相對強度為17.03%(表1),前三位分別是多肽KEFT(賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸),EEASA(谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸)和RYDD(精氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),相對強度分別為4.24%、3.93%和3.43%。動物實驗和臨床研究證明,精氨酸(R)和亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)三種支鏈氨基酸具有抗疲勞效果[16-17]。金槍魚紅肉酶解液高豐度多肽多含有一個或多個抗疲勞氨基酸,推測其具有抗疲勞效果。

2.2 小鼠疲勞指標的比較

2.2.1 疲勞相關的生理指標 在8周里,酶解液減緩了小鼠的體重增加(圖1A),降低了最終體重增量,雌雄小鼠間不存在顯著性差異(圖1B)。抗疲勞能力與機體肝臟功能之間存在較為密切的聯(lián)系[18],本研究對肝臟系數(shù)進行了定量分析。結果發(fā)現(xiàn),酶解液增加了小鼠的肝臟系數(shù)(圖1C)。轉棒實驗表明,酶解液將雄性和雌性小鼠的轉棒時間分別延長了72.8%和70.8%(圖1D),說明金槍魚酶解液顯著提升了小鼠抗疲勞能力。

圖1 疲勞相關的生理指標Fig.1 Physiological indexes related to fatigue.注:**表示差異極顯著,P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。圖2、圖3同。

2.2.2 疲勞相關的生化指標 肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和乳酸(LD)含量是常見的用于衡量疲勞狀態(tài)的關鍵性指標,疲勞狀態(tài)與肌酸激酶活力和乳酸含量呈正相關,與乳酸脫氫酶活力呈負相關[19]。本研究中,酶解液降低了血清中肌酸激酶活性和乳酸含量,增加了乳酸脫氫酶活性,雌雄小鼠變化規(guī)律一致(圖2A～C)。一般認為,提高體內抗氧化酶的活性,清除超氧陰離子自由基,可以達到抗疲勞的效果。本研究中,酶解液增加了血清和肝臟中的谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,降低了丙二醛濃度(圖2D～F)。

圖2 疲勞相關的生化指標Fig.2 Biochemical indexes related to fatigue

2.3 小鼠腸道菌群物種豐度和多樣性分析

Observed species指數(shù)和Chao1指數(shù)用來表征腸道菌群物種豐富度,Shannon指數(shù)用來評估腸道菌群物種多樣性。結果發(fā)現(xiàn),酶解液降低小鼠腸道菌群的豐富度(圖3A、B),極顯著降低8周雌性小鼠菌群的多樣性(P<0.01)，而對雄性小鼠菌群多樣性沒有影響(圖3C)。以上分析表明,酶解液對腸道菌群的豐富度和多樣性均具有影響,且對多樣性的影響具有性別差異。肥胖會導致腸道菌群豐富度和多樣性的降低[20],但是同為慢性代謝綜合癥的2型糖尿病和D-半乳糖誘導的腦衰老則會導致腸道菌群豐富度和多樣性的增加[21-22]。因此,簡單地通過菌群豐富度和多樣性參數(shù)的變化,不足以評估酶解液的益生元效果。

圖3 小鼠腸道菌群物種豐富度和多樣性Fig.3 Bacterial richness and diversity of gut microbiota in mice

2.4 小鼠腸道菌群結構分析

為了進一步明確酶解液對小鼠腸道菌群的影響,我們對腸道菌群結構進行了加權主坐標分析(Weighted Unifrac Principal Co-ordinates Analysis)。雌雄小鼠的腸道菌群結構存在差異,雌性小鼠組全部位于PCoA1軸的上方,而雄性小鼠組全部位于PCoA1軸的下方,這種腸道菌群結構的性別差異在之前的文獻中多有報道[23-24]。在0周時,實驗組和對照組小鼠的菌群結構沒有差別,而隨著灌胃時間的延長(4周和8周),菌群結構逐漸產(chǎn)生差異(圖4)。

圖4 小鼠腸道菌群的加權主坐標分析結果Fig.4 The results of weighted unifrac principal co-ordinates analysis

2.5 小鼠腸道菌群分類結構變化

2.5.1 門水平相對豐度 小鼠腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門是相對豐度最高的兩個菌門(圖5A)。酶解液使雄性小鼠擬桿菌門的相對豐度從66.5%±5.0%降低到55.4%±4.8%(P<0.05),厚壁菌門的相對豐度從29.9%±4.6%升高到33.7%±4.6%;而使雌性小鼠的擬桿菌門從42.9%±5.0%增加到61.9%±4.4%,厚壁菌門從53.5%±4.9%降低到33.9%±4.6%,說明這兩個主要菌門的豐度變化存在性別差異。

2.5.2 綱水平相對豐度 綱水平結果表明,擬桿菌綱(Bacteroidia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Clostridia)是小鼠腸道菌群中的主要菌綱(圖5B),其中擬桿菌綱屬于擬桿菌門,芽孢桿菌綱和梭菌綱屬于厚壁菌門。在雄性處理組中,擬桿菌綱和芽孢桿菌綱相對豐度均降低,而梭菌綱豐度升高;在雌性處理組中,擬桿菌綱豐度先降低再升高,芽孢桿菌綱豐度升高而梭菌綱豐度降低。

圖5 小鼠腸道菌群在門水平和綱水平的相對豐度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota in the phylum and class levels

本研究中門水平和綱水平的菌群變化規(guī)律較為復雜,難以得到一致性的規(guī)律,

這可能是由于門水平和綱水平的分類層級較高,在相同的門或者綱下面包含不同的目、科、屬和種的微生物,這些微生物在功能和特性上存在較大的差異,對酶解液響應也各不相同。

2.6 小鼠腸道菌群中功能操作分類單元(OTUs)分析和鑒定

在雄性小鼠的17個關鍵性OTUs中(圖6A),豐度上升的OTUs有6個,屬于乳酸菌屬和未分類的梭菌目等;豐度下降11個,

圖6 雄性(A)和雌性(B)小鼠中的關鍵OTUsFig.6 Key OTUs responding to hydrolysate of tuna dark meat treatment in male(A)and female mice(B)注:OTUs按照進化樹排列,利用顏色表征OTUs豐度,處理之后豐度增加的 OTUs用下劃線標注,OTUs對應的分類信息(門和屬)標注在右側。

屬于未分類的梭菌目等。研究表明,乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物可以增加小鼠耐力,對慢性疲勞綜合癥的緩解具有效果[25-26];梭菌XlVa簇是一種短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,具有提高腸道揮發(fā)性脂肪酸含量和抗氧化的能力[27]。這兩個屬豐度的增加,可以促進小鼠耐力和抗氧化能力的提高。此外,同屬于未分類的梭菌目的兩個OTUs具有相反的變化趨勢,推測是不同種水平的變化差異導致屬水平變化趨勢的不一致[28]。

在雌性小鼠的58個關鍵OTUs中(圖6B),豐度上升和下降的OTUs 分別有34個和24個。本研究共鑒定到9個關鍵OTUs屬于乳桿菌屬,其中7個的豐度上調。乳桿菌屬是耐力運動的運動員腸道中的優(yōu)勢菌群,其發(fā)酵產(chǎn)物具有抗運動疲勞作用[29-30]。瘤胃球菌屬也屬于短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,其有助于腸道穩(wěn)態(tài)的維持[31],本研究中有3個關鍵OTUs屬于瘤胃球菌屬,其中一個豐度增加,另兩個豐度下降。此外,有16個屬于未分類的卟啉單胞菌屬的OTUs豐度上升。卟啉單胞菌屬已被證明與口腔炎癥有關[32],酶解液為何會促進其在雌性小鼠腸道菌群中大幅增加,仍需進一步研究。

雌雄小鼠關鍵OTUs相似度極低,僅有3個共有OTUs,其中2個變化趨勢一致。這說明酶解液對腸道菌群的調節(jié)具有性別差異。但是,這個差異性的菌群調節(jié)是否是抗疲勞效果差異的原因之一,仍需要進一步的研究。

3 結論

本研究鑒定了金槍魚紅肉酶解液中的多肽組成及其豐度,并考察了其在小鼠中的抗疲勞、抗氧化效果;同時從腸道菌群角度,研究了酶解液對腸道菌群的調節(jié)作用。結果表明,金槍魚酶解液中的優(yōu)勢多肽多含有支鏈氨基酸和精氨酸等與抗疲勞效果有關的氨基酸;酶解液增加了小鼠的抗疲勞和抗氧化能力,增加了血清和肝臟中乳酸脫氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活力,降低了肌酸激酶活力、乳酸和丙二醛含量。

酶解液對腸道菌群的調節(jié)具有性別差異:雄性小鼠菌群物種豐富度降低,多樣性保持不變,而雌性小鼠菌群物種豐富度和多樣性均降低;雄性小鼠擬桿菌門相對豐度降低而厚壁菌門相對豐度升高,而雌性小鼠這兩個門的變化趨勢正好相反;雄性小鼠和雌性小鼠中分別鑒定得到17個和58個關鍵性OTUs,相同的關鍵性OTUs僅為3個,其中2個OTUs變化趨勢一致。

綜上所述,金槍魚紅肉酶解液因含有豐富的精氨酸和與抗疲勞相關的支鏈氨基酸,對小鼠具有抗疲勞、抗氧化的效果,對腸道菌群也具有一定的調節(jié)作用,這種調節(jié)存在性別差異性。