同時性結直腸癌原發灶和肝轉移灶中KRAS基因突變的一致性分析

林 奇，周鵬揚，莊奧博，許劍民

復旦大學附屬中山醫院普通外科，上海 200032

約25%的結直腸癌(colorectal cancer, CRC)患者在首診時即發現有同時性肝轉移，15%～25%的患者會發生異時性肝轉移[1-2]。無法手術切除的結直腸癌肝轉移(colorectal liver metastasis, CRLM)患者的中位生存時間僅為2.3～21.3個月[3]，而手術切除是患者獲得治愈的唯一途徑，約25%～50%的患者獲得手術切除后能存活超過5年[2, 4-5]。但是，即使獲得R0切除的患者也有超過2/3會在2年內再次復發，從而無法獲得長期生存[1, 6-7]。

轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)在臨床表現和生物學方面均存在高度異質性[8]，因此需要對患者進行分層治療。目前，包括肝轉移灶大小和數目、原發灶術后發生肝轉移的間隔時間、糖類抗原(CEA)水平和原發灶分期在內的臨床風險評分(clinical risk score, CRS)已無法精確判斷術后mCRC復發率和決定手術選擇[9-11]。因此，有必要納入更多的分子標志物，以提高療效預測的準確性。

KRAS基因作為RAS基因家族(包括KRAS、NRAS和HRAS)的成員，在上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)信號通路的下游發揮作用，促進mCRC的發生和進展[12-13]。32%～40%的mCRC腫瘤組織中存在KRAS突變，其中85%～90%的突變位于密碼子12和13，密碼子61和146各占5%[12]。目前KRAS突變已成為不能獲得抗EGFR治療療效的標志[12-15]。同時，已有研究[9, 16-17]表明KRAS的突變還可以作為CRLM切除術后的預后因素。但是目前缺乏對于初始可切除同時性結直腸癌肝(synchronous colorectal liver metastases，SCRLM)轉移同期切除術后的預后研究。本研究比較了SCRLM患者原發灶和轉移灶中KRAS基因突變的差異，同時分析了KRAS突變對于初始可切除SCRLM患者同期切除術后預后的影響。

1 資料與方法

1.1 入組標準 收集2003年7月至2013年7月在復旦大學附屬中山醫院行同期切除的139例同時性結直腸癌肝轉移患者的臨床資料。入組標準[18]：(1)原發灶和肝轉移灶初始可以切除，肝外轉移灶可獲得R0切除；(2)術后肝容量≥ 50%；(3)保留肝臟解剖功能。術前接受過肝切除或者射頻消融治療的患者排除出組。所有患者術前均經結直腸多學科團隊根據患者的一般情況和檢查結果進行評估，決定具體治療方案。具體手術由固定的結直腸外科和肝外科手術小組共同完成。

1.2 數據收集及隨訪 患者的基本情況、臨床病理數據、手術過程、手術死亡率以及術后短期療效(術后并發癥)和長期療效(術后生存情況)的數據和資料均錄入結直腸癌肝轉移數據庫。由專職人員負責隨訪，每半年隨訪1次，隨訪截止時間為2014年12月31日。隨訪采用門診、電話、書信形式。隨訪內容包括腫瘤指標、胸X線片、彩超、CT和MRI等，必要時行PET-CT檢查。無瘤生存時間(disease-free survival, DFS)是自手術切除至發現復發或轉移的時間；總生存時間(overall survival, OS)是自手術切除至最后1次隨訪或因該疾病死亡的時間。

1.3 基因突變檢測 選取結直腸癌原發灶和轉移灶石蠟標本，采用基因科技(上海)有限公司“GTpure FFPE組織DNA提取試劑盒”，從石蠟切片中抽提基因組，制備DNA模板，PCR擴增后行Pyrosequencing焦磷酸測序。檢測KRAS基因12、13、61和146密碼子突變情況[13]。

1.4 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件進行分析，計數資料的比較采用χ2檢驗(或校正χ2檢驗)，計量資料的比較采用t檢驗，原發灶和轉移灶突變率的差異采用配對樣本的非參數檢驗(Wilcoxon)。存活率采用壽命表法進行推算,用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，并采用log-rank法進行比較。多因素分析用Cox比例風險回歸模型。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 患者的臨床病理特征 139例行結直腸癌原發灶和肝轉移灶同期切除患者中58.3%(81/139)的患者為男性，60.0%(89/139)的患者年齡小于60歲，69.8%(97/139)的患者腫瘤原發部位在結腸，肝轉移灶數目為1.0～7.0(1.85±1.14)個，最大轉移灶的直徑為(3.79±2.32) cm (0.5～15 cm，表1)。

2.2 手術方式及術后并發癥 139例患者均獲得了原發灶和肝轉移灶R0切除，28.1%(39/139)的患者出現并發癥，發生率較高的是少量腹腔積液(7.2%，10/139)，膈下積液(5.8%，8/139)，胸腔積液(5.0%，7/139)，并發癥較重的為膽漏(1.4%，2/139)，以及吻合口漏(1.4%，2/139)，這些并發癥均經胸腹腔引流、抗炎支持治療等非手術治療措施獲得治愈或明顯緩解。

表1 KRAS基因狀態和臨床病理特征的相關性

a因2例KRAS野生型患者未查CEA，僅納入137例分析

2.3 KRAS突變在原發灶和轉移灶中的一致性分析及其與臨床病理因素的關系 139例患者的原發灶中，KRAS突變占28.8%(40/139)，其中22.3%(31/139)為密碼子12突變，6.5%(9/139)為密碼子13突變。原發灶和轉移灶均完成KRAS突變檢測者有95例(44例患者因資料不全未完成相應配對檢測)，28例患者原發灶和轉移灶中均有突變，其突變位完全一致；均無突變者65例；僅有2例患者原發灶中無突變，而在轉移灶中檢測到了KRAS突變。采用配對樣本的非參數檢驗發現，原發灶[29.5%(28/95)]和轉移灶[31.6%(30/95)]的突變率，差異無顯著統計學意義(P=0.157)。

經過χ2檢驗，KRAS的突變和年齡、性別、原發灶位置、組織學類型、腫瘤分化、T分期、N分期、血管浸潤、神經浸潤、肝轉移灶數目、肝轉移灶最大直徑以及CEA水平等臨床病理因素之間均無顯著相關性(表1)。

2.4 生存分析 截至隨訪日期，139例患者的5年OS為50.0%，5年DFS為36.0%。其中28.8%(40/139)的患者已經死亡，49.6%(69/139)的患者出現腫瘤復發，35.3%(49/139)的患者僅有肝內復發，6.5%(9/139)的患者僅有肺內轉移。Kaplan-Meier曲線生存分析(圖1)發現，KRAS突變野生型患者OS沒有顯著差異(P=0.213)，KRAS突變患者的DFS明顯短于野生型患者(P=0.041)。多因素分析發現，轉移灶數≥ 4(P=0.005)和KRAS突變(P=0.012)是短DFS的獨立預后因素(表2)。

表2 DFS相關因素分析

圖1 KRAS突變和OS及DFS的相關性

3 討 論

同期切除結直腸原發灶和肝轉移灶曾被認為會增加手術并發癥和圍手術期死亡率[19-20]，但是隨著手術、麻醉和重癥監護等技術的進步，近年來肝切除(包括半肝切除)的并發癥發生率和死亡率逐漸下降，同期切除原發灶和肝轉移灶逐漸得到了開展[4, 21-23]。和分期切除相比，同期切除后5年OS和DFS也無明顯差異[3-4, 24]。同期切除不僅能減少住院費用和減輕患者二次手術的精神負擔，重要的是避免腫瘤進展或化療導致的肝損傷貽誤手術時機[3]。本研究結果顯示：圍手術期死亡率為0%，雖然28.1%的患者出現了術后并發癥，但均經非手術治療后獲得治愈或明顯緩解，充分說明同期切除結直腸癌肝轉移是安全可行的。同時，這些患者的5年OS達到了50.0%，5年DFS為36.0%，這些生存數據也從腫瘤學角度說明同期切除的可行性。但是肝轉移灶術后的高復發率(本研究復發率為49.6%)仍然是外科醫生面臨的難題。既往的臨床病理因素評估體系已經不能精確判斷預后，需要從分子水平尋找更多的療效預測標志物，用于篩選病例，避免不必要的手術。

目前KRAS突變已成為不能獲得抗EGFR治療療效的標志[12-15]，臨床意義重大。但是因為腫瘤的高異質性，還不能確定原發灶和轉移灶之間KRAS突變率是否存在差異。本研究結果顯示：原發灶和轉移灶之間KRAS突變差異無統計學意義，對原發灶中基因突變的檢測可以代表轉移灶中基因突變情況，這和既往的一些研究[25-28]結果一致。本研究發現，2例患者原發灶中無突變，轉移灶中檢測到了KRAS突變。Vakiani等[27]研究表明僅有2.4%(2/84)的患者在原發灶中KRAS無突變，而在轉移灶中發現突變，且研究者懷疑可能由多原發腫瘤導致；也有研究中多達6%(5/83)的患者原發灶中存在KRAS突變，而在轉移灶中未發現突變[25]。而研究[28]發現，11.3%的mCRC患者原發灶腫瘤為KRAS突變型，而轉移灶為野生型。這些研究充分說明了原發灶和轉移灶之間的異質性。另外靶向治療可導致KRAS基因型的改變[28]，這提醒臨床治療效果不佳時，需要考慮行病灶的重新穿刺活檢或液態活檢進一步明確基因狀態，適時調整治療方案。本研究的缺陷為：對于存在多個轉移灶的患者，沒有檢測所有轉移灶的突變情況。

目前已有一些研究得出KRAS突變和肝臟轉移灶切除術后短OS[16, 29-31]和DFS[16-17, 29, 31-34]相關，同時KRAS突變是短OS[16, 30, 35-36]和DFS[31, 33-35]的獨立預后因素。本研究僅發現KRAS突變和短DFS相關，且是DFS的獨立預后因素，表明KRAS突變的患者術后容易復發，在決定同期手術決策時需要考慮KRAS狀態。