沙眼衣原體pORF5質粒蛋白通過HMGB1抑制細胞凋亡機制的初步研究

雷文波 何蓓 聶倩 文雅婷 趙鈺琦 李忠玉

南華大學衡陽醫學院病原生物學研究所 特殊病原體防控湖南省重點實驗室，湖南衡陽421001

沙眼衣原體（Ct）是一種嚴格細胞內寄生的原核細胞型微生物，抑制宿主細胞凋亡是Ct完成細胞內生長發育的必要條件［1-2］。線粒體是細胞凋亡調控的活動中心，Bcl-2蛋白家族在線粒體介導的細胞凋亡中發揮重要的調控作用。Ct通過多種機制調控Bcl-2蛋白家族的表達進而調節線粒體功能抑制宿主細胞凋亡［3-5］：Sharma等［3］研究發現，缺氧誘導因子1α通過上調Bcl-2抗凋亡家族蛋白Mcl-1抑制Ct感染的細胞凋亡；Rajalingam等［4］發現Ct通過激活Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信號通路，穩定和上調Mcl-1蛋白表達水平，從而保護Ct感染的細胞免受凋亡刺激因子引起的凋亡。

pORF5是Ct質粒編碼的一種分泌性蛋白［6］，本課題組前期研究證實，pORF5能促進宿主細胞高遷移率族蛋白1（HMGB1）表達上調［7］，HMGB1是一種高度保守的核內非組蛋白，在調控細胞凋亡過程中發揮重要作用［8-9］。為探討pORF5質粒促進HMGB1表達對細胞凋亡的影響及機制，我們用pORF5質粒蛋白刺激HMGB1 shRNA干擾的HeLa細胞，通過對線粒體膜電位、細胞色素c（Cyt c）的釋放以及Bcl-2、Bax、胱天蛋白酶3（caspase-3）等凋亡相關分子的檢測，綜合分析pORF5質粒蛋白抗凋亡的分子機制，為Ct感染性疾病的防治提供實驗依據。

材料與方法

一、主要實驗試劑與細胞

兔抗Bcl-2、Bax和caspase-3多克隆抗體產自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗Cyt c多克隆抗體產自美國Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、Cy3標記的羊抗兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體產自美國Proteintech公司；JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒來自上海碧云天公司；凋亡誘導劑碳酰氰基-對-氯苯腙（CCCP）為美國Sigma公司產品；HeLa細胞株、HMGB1干擾的HeLa細胞（shHMGB1-HeLa）和對照RNA干擾的HeLa細胞（對照RNA-HeLa）為本研究所保存［10］。

二、細胞培養與分組

用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、5%CO2的環境中培養HeLa細胞。當HeLa細胞處于對數生長期時，將其分成2組，一組用10μmol/L CCCP處理30 min作為對照組，另一組為pORF5與CCCP共處理組，即用10 mg/L pORF5蛋白（本課題組通過原核表達制備保存）刺激18 h后，再用10μmol/L CCCP處理30 min。為了分析HMGB1是否參與pORF5質粒蛋白的抗凋亡作用，部分實驗中用pORF5質粒蛋白和CCCP共刺激shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細胞，刺激方法同上。

三、間接免疫熒光檢測Cyt c釋放情況

取生長狀態良好的HeLa細胞、shHMGB1-HeLa細胞和對照RNA-HeLa細胞，0.25%胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，將細胞密度調整為5×105個/ml后接種于24孔細胞培養板中，過夜培養，待生長至融合度約80%時，按照上述分組方法處理細胞后，去除細胞培養基，PBS洗滌細胞，依次經4%多聚甲醛固定30 min、0.5%Triton X-100透膜10 min、血清封閉30 min，再加入1∶1 000稀釋的兔抗Cyt c抗體孵育2 h后，加入Cy3標記的羊抗兔熒光二抗孵育2 h，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色1 h，封片后熒光顯微鏡觀察細胞內Cyt c的分布情況。

四、JC-1熒光染色檢測線粒體膜電位

用PBS洗滌經CCCP單獨或與pORF5共處理的HeLa細胞、shHMGB1-HeLa細胞和對照RNAHeLa細胞后，加入1 ml JC-1染色工作液，置于細胞培養箱中37℃避光孵育20 min，用JC-1染色緩沖液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察結果，根據紅色與綠色熒光強度比率來判斷線粒體膜電位變化。

五、Western印跡檢測凋亡相關蛋白的表達

收集經上述處理的HeLa細胞、shHMGB1-HeLa細胞、對照RNA-HeLa細胞并用RIPA裂解液裂解細胞，離心收集蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白加入上樣緩沖液，混合均勻后煮沸5 min，將樣本經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別以兔抗Bcl-2、Bax和caspase-3抗體作為一抗，辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體作為二抗進行Western印跡檢測，用ECL試劑顯影，以目的蛋白與GAPDH蛋白的灰度值之比表示蛋白表達水平。

六、統計學分析

結 果

一、pORF5質粒蛋白拮抗CCCP誘導的線粒體膜電位下降

見圖1。CCCP處理后HeLa細胞線粒體膜電位較低，紅/綠熒光強度比率為0.4±0.1；而CCCP與pORF5質粒蛋白共處理后，線粒體維持較高的膜電位，細胞主要發出紅色熒光，紅/綠熒光強度比率為1.7±0.3，顯著高于對照組（t=6.95，P＜0.01）。

圖1 JC-1熒光探針分析pORF5對HeLa細胞線粒體膜電位的影響

二、pORF5質粒蛋白對凋亡相關蛋白表達的影響

與對照組比較，共處理組HeLa細胞Bcl-2蛋白的表達水平增加（5.3±0.6）倍（t=8.62，P＜0.01），Bax平均表達水平降低79%±10%（t=9.23，P＜0.01），caspase-3活化片段P17平均含量減少75%±8%（t=4.26，P＜0.05）。見圖2。

三、間接免疫熒光法檢測Cyt c釋放情況

對照組HeLa細胞胞質Cyt c呈均勻彌散紅色熒光，而pORF5質粒蛋白處理組Cyt c呈點狀分布（圖3）。

四、pORF5質粒蛋白通過上調HMGB1的表達抑制細胞凋亡

經pORF5質粒蛋白和CCCP共處理后，JC-1熒光探針檢測顯示，對照RNA-HeLa細胞存在大量紅色熒光，紅/綠熒光強度比率為1.2±0.2；而shHMGB1-HeLa細胞表現出去極化的線粒體膜電位，紅色熒光信號明顯減少，綠色熒光信號增強，紅/綠熒光強度比率為0.3±0.1，顯著低于對照RNAHeLa細胞（t=11.23，P＜0.01）。見圖4。

圖4 JC-1熒光探針分析HMGB1對shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細胞線粒體膜電位的影響

Western印跡結果顯示，shHMGB1-HeLa細胞中Bax平均表達水平較對照RNA-HeLa細胞增加（1.2±0.2）倍（t=13.06，P＜0.01），Bcl-2平均表達水平較對照RNA-HeLa細胞降低56%±7%（t=7.19，P＜0.05）（圖5）。間接免疫熒光法顯示，與對照RNA-HeLa細胞比較，shHMGB1-HeLa細胞中Cyt c從線粒體釋放量增加，見圖6。

討 論

Ct的生長繁殖需要宿主細胞提供生存環境及營養物質，為順利完成在細胞內的發育周期，Ct通過多種機制調控宿主細胞［1-5］。線粒體膜電位變化是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，也是細胞凋亡發生的一個重要步驟。Ct pORF5具有抑制細胞凋亡、促進炎癥反應等多方面功能［11-13］。為進一步分析pORF5抗凋亡分子機制，我們用pORF5蛋白和凋亡誘導劑CCCP聯合處理細胞，發現pORF5能拮抗CCCP誘導的線粒體膜電位下降，初步證實pORF5可通過保護線粒體功能抵抗凋亡誘導劑誘導的細胞凋亡。

圖5 HMGB1對shHMGB1-HeLa和對照RNA-HeLa細胞Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

圖6 間接免疫熒光技術檢測HMGB1對HeLa細胞細胞色素c（Cyt c）釋放的影響

Bcl-2家族蛋白可通過調控線粒體結構與功能的穩定性調節細胞凋亡。當細胞受到凋亡誘導因子刺激后，促凋亡蛋白Bax和Bak被激活，并在線粒體外膜上發生寡聚化，Bax/Bak復合體與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，致線粒體通透性增加，促進Cyt c從線粒體上釋放，釋放的Cyt c激活caspase-3，使無活性的caspase-3前體裂解為有活性的P17和P15兩個亞單位，從而啟動細胞凋亡，但抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL可阻斷Bax/Bak激活的通道抑制細胞凋亡［14］。本實驗顯示，pORF5能降低Bax和活化caspase-3的表達，促進Bcl-2蛋白的表達，并能顯著抑制Cyt c釋放。提示pORF5質粒蛋白通過上調抗凋亡蛋白Bcl-2、下調促凋亡蛋白Bax的表達，抑制線粒體介導的凋亡途徑從而發揮抗凋亡作用。

HMGB1是一種DNA結合蛋白，具有調節基因轉錄，參與DNA重組修復和復制等作用［15-16］；在細胞損傷和炎癥反應時，HMGB1可分泌到細胞外，介導炎癥和細胞增殖、凋亡抑制等多種生物學功能［8-9，17］。前期研究發現，pORF5質粒蛋白能上調宿主細胞HMGB1的表達［7］，本研究中我們用RNA干擾技術干擾HMGB1表達后，HeLa細胞線粒體膜電位顯著降低，細胞凋亡相關蛋白Bax的表達水平增加，而抑制細胞凋亡的Bcl-2表達水平降低，Cytc從線粒體釋放量增加，提示HMGB1在pORF5質粒蛋白抗凋亡作用過程中發揮重要作用。

綜上，我們通過pORF5質粒蛋白體外刺激HeLa細胞，發現pORF5可調控Bcl-2和Bax等凋亡相關蛋白的表達，并抵抗CCCP誘導的線粒體膜電位下降和Cyt c釋放，初步證實pORF5可抵抗線粒體途徑介導的細胞凋亡；并發現HMGB1敲低能顯著抑制pORF5質粒蛋白抗凋亡能力，證實pORF5通過HMGB1調控宿主細胞凋亡。促進HMGB1表達進而調節宿主細胞死亡信號通路可能是有助于Ct建立對自身生長發育有利環境的一個重要生物學事件。本研究可豐富Ct抗凋亡分子機制，為Ct感染性疾病的預防和治療提供實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突