一漢族念珠狀發家系調查和Ⅱ型毛發角蛋白基因突變分析

王霞 楊閣 李凌 魏榮芳 熊春萍

1廣州醫科大學附屬第一醫院皮膚科510120；2梅州市人民醫院皮膚科，廣東梅州514023

念珠狀發（monilethrix，OMIM：158000）是一種罕見的毛干結構異常的遺傳性疾病［1］，1879年由Smith首次描述。該病多數為常染色體顯性遺傳，偶有呈常染色體隱性遺傳的病例報道［2-3］。臨床以毛干間斷性規則或不規則縮窄進而形成念珠狀毛發為特征，縮窄部易折斷，頭發呈局限性或彌漫性稀疏，短、干枯、無光澤，重者累及全身毛發，常伴毛囊角化性丘疹［4-5］。目前，國外學者認為該病的發生與毛發角蛋白基因突變可能有關［6］。然而，國內學者對念珠狀發的研究較少，對該病的致病突變尚未明確。我們收集到一個中國廣東籍漢族念珠狀發家系，發現3代15人中存在4例念珠狀發患者，我們對該家系成員進行分子遺傳學研究，以期發現致病突變，為該病的診斷提供更多的理論依據。

一、資料與方法

1.臨床資料：先證者女，8歲，廣東省人，漢族，因毛發稀少7年余來廣州醫科大學附屬第一醫院脫發專科就診。出生時頭發無明顯異常，在約2個月后，部分頭發開始變得脆弱易折斷，干燥而無光澤，容易拔出。頭發稀疏，以枕部尤甚，冬季加重，春季緩解，無自覺癥狀。父母非近親結婚，母親妊娠期無特殊疾病和服藥史，足月順產。皮膚科檢查：頭部毛發彌漫性稀疏（圖1A），多數為2 cm斷發，外觀異常，肉眼可見頭部散在串珠狀發，以枕部為多，項部見毛囊角化性丘疹，眉毛、睫毛正常。指趾甲正常。皮膚鏡檢查：右顳部毛發發生典型的念珠狀改變，枕部較多毛發亦呈念珠狀改變，散在少數斷發，丘疹上見小黑點狀斷發（圖2A）。光鏡下病發膨大與縮窄交替出現，呈典型的規則串珠狀改變（圖2B）；掃描電鏡檢查示病發膨大部可見疊瓦狀毛小皮，毛小皮基本正常（圖2C），病發縮窄部可見大量毛小皮破壞、斷裂、消失，并見明顯的縱嵴、縱溝（圖2D）。給予患兒2%米諾地爾溶液連續外搽9個月，毛發變密且明顯變長（圖1B），皮膚鏡檢查仍見念珠狀發，但較先前減少。

圖1 念珠狀發先證者臨床表現

圖2 念珠狀發患者毛發皮膚鏡、光鏡和掃描電鏡下圖像

調查顯示，該家系3代共15人，對家系中毛發異常的成員同時進行皮膚鏡、光鏡和掃描電鏡檢查，發現4例患者（男2例，女2例，包括患兒）毛發存在典型的念珠狀改變，符合念珠狀發的初步診斷。該家系中男女均患病，呈垂直傳遞現象（圖3），符合常染色體顯性遺傳模式特征。本研究經廣州醫科大學附屬第一醫院醫學倫理委員會批準（醫研倫審2019第K-04號），受試者均簽署知情同意書。

圖3 念珠狀發家系圖

2.DNA提取：抽取患者、14名家系成員和100例健康對照靜脈血各5 ml，2%乙二胺四乙酸抗凝，-80℃凍存。采用全血基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取外周血DNA。

3.PCR擴增：參考以往研究結果，念珠狀發突變位點集中在Ⅱ型毛發角蛋白1（hHb1）、hHb3和hHb6外顯子1和7上，因此采用Primer 5.0引物設計軟件針對hHb1、hHb3和hHb6外顯子1和7設計引物，擴增目標序列及超出目標序列邊界（內含子內）50 bp的序列，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成（表1）。

PCR反應體系為50μl，其中反應液包括5μl緩沖液、0.5μl 10 mmol/L dNTP、上下游引物各0.5μl、Taq酶0.5μl、25 mmol/L MgCl25μl、二甲基亞砜1.5μl、DNA模板10μl。反應條件：94℃預變性1.5 min，94℃30 s，62℃30 s，72℃60 s，共35個循環。PCR產物用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。將PCR產物送至廣州基地奧生物科技有限公司測序，將結果與NCBI中GenBank數據庫目標基因序列進行比對，分析突變位點。

表1 hHb1、hHb3和hHb6基因外顯子1和7的引物序列

二、結果

電泳檢測顯示在患者、家系成員和對照組樣本中均擴增出hHb1、hHb3和hHb6基因外顯子1和7序列，其中hHB6基因外顯子7擴增條帶長465 bp。

測序結果顯示，患者及其他家系成員和對照組的hHb1、hHb3外顯子1和7及hHb6外顯子1均未見突變。先證者及家系中其他3例患者在hHB6基因外顯子7第1 237位堿基處均存在雜合突變（G＞A），導致編碼氨基酸的密碼子由CGA突變為CAA（谷氨酸突變為賴氨酸，即E413K），而家系健康成員及100例健康對照未檢測到該突變，測序結果見圖4。

圖4 念珠狀發患者及健康對照hHB6基因第7外顯子PCR產物測序圖

三、討論

念珠狀發具有較高的外顯率和不同的臨床表現［7］。自1997年Winter等［8］發現第一個念珠狀發hHb致病突變至今，共發現10種hHb點突變與念珠狀發相關［9-10］。這些突變全部發生于Ⅱ型毛發角蛋白hHbl、hHb3和hHb6基因。目前，國內在念珠狀發患者中發現兩種雜合突變，分別為hHb6基因E402K和R430Q［11-13］。本研究中，我們發現一念珠狀發家系中4例患者hHb6基因外顯子7第1 237位堿基存在G＞A轉變，即E413K。在PubMed、中國知網和萬方醫學等數據庫中以“念珠狀發、hHb、基因和突變”等為關鍵詞檢索，國內未發現hHb6基因E413K突變位點的報道，但該突變在國外報道中是念珠狀發的一個突變熱點［14］。hHb6位于毛發角蛋白的2B區，該區域在角蛋白中間絲裝配中起重要作用。分子動力學研究表明，谷氨酸突變為賴氨酸可引起突變區域肽鏈構象的顯著變化及原子/基團間靜電相互作用力的改變，進而影響角蛋白中間絲的裝配及穩定性［15］，穩定性發生改變的中間纖維絲會導致患者的頭發呈念珠狀［16］，因此該突變可能是導致本文家系患者念珠狀發的原因。

念珠狀發呈慢性病程，目前臨床上尚無確切有效的治療方法。近期有報道外用米諾地爾溶液以及口服阿維A類制劑治療有效［17］。考慮到先證者為女童，所以選擇2%米諾地爾溶液外搽，治療9個月后取得良好的效果，而停藥2年后隨訪毛發仍持續變密，推測可能是用藥期間米諾地爾溶液通過促進毛發生長期的發育和擴張頭皮血管促進毛發生長，同時本病隨年齡增長有自行緩解趨勢，其具體機制有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突