上海地區幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的相關基因檢測

黃聲雷， 郭 瑋， 胡必杰， 周春妹， 潘柏申

幽門螺桿菌（Hp）對克拉霉素耐藥是由于該菌的23S rRNA基因發生了某個位點突變導致了核糖體構象改變，使大環內酯類抗生素結合位點也隨之發生改變，從而干擾了克拉霉素與細菌結合而產生耐藥。1996年Stone等[1]發現并報道了Hp對克拉霉素耐藥的分子基礎主要是23S rRNA基因中2143位點上A突變為G。在我國Hp 23S rRNA基因2143單位點的突變是導致對克拉霉素耐藥的主要原因。2001年研究顯示北京地區耐克拉霉素的Hp 23S rRNA基因A2143G突變率高達100%[2]，2008年淮南地區耐藥Hp A2143G的突變率也高達100%[3]。

隨著分子生物學技術的發展，常用PCR方法如PCR限制性片段長度多態性分析技術、熒光PCR原位雜交、23S rRNA基因組測序等被推薦用于檢測Hp的耐藥性。為了了解上海地區耐克拉霉素Hp的23S rRNA基因突變情況，同時為了提高樣本Hp檢測的陽性率，本研究使用兩種不同PCR方法，包括測序方法和熒光PCR熔解曲線法，直接對快速尿素酶試驗篩查Hp陽性患者的胃黏膜組織標本進行Hp耐藥基因的檢測，評估兩種檢測方法結果的一致性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 2017年9-12月因上消化道癥狀于復旦大學附屬中山醫院接受胃鏡檢查患者，選取快速尿素酶試驗Hp陽性患者的尿素酶試管中廢棄的胃黏膜組織標本80份。

1.1.2 主要試驗材料 自動化樣品研磨勻漿器和無菌去熱源鋼珠（TissueLyserⅡ） 購自德國QIAGEN公司，商品化自動核酸提純及熒光PCR分析儀TCG-D1型由踏石生物科技蘇州有限公司提供；配套商品化試劑盒包括聚合酶試劑（KOD Mix）；引物HPC-F5'-GTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCC-3，HPCR5'-GGCTCCATAAGAGCCAAAGCCCTTAC-3'；熒光探針序列：5'-CAAGACGGAAAGACCC-3'；氟硼二吡咯熒光染料 （HPC Mix）；樣本稀釋液（含1%磷酸緩沖液和99%無菌水）；樣本萃取液（含1%pH調整劑的無菌水溶液），商品化試劑盒由踏石生物科技蘇州有限公司提供；DNAiso試劑盒和Ex Taq DNA聚合酶購自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 標本處理 將胃黏膜組織標本放入含有0.9%NaCl溶液1.5 mL平底無菌離心管中，向管內放入無菌去熱源直徑為0.2 cm鋼珠，將離心管固定在自動化樣品研磨勻漿器，來回振蕩研磨。設置儀器參數為：震蕩頻率60次/min，時間15 min。取180 μL樣本稀釋液和200 μL胃黏膜組織勻漿移至0.5 mL無菌離心管中；12 000 r/min室溫離心5 min，棄上清液向含沉淀物的離心管中加入50 μL樣本萃取液，渦旋振蕩混勻5～6 s；將離心管放置于95 ℃恒溫孵育箱5 min備用。

1.2.2 全自動核酸提純及熒光PCR分析儀操作 根據廠家提供的商品化PCR儀配套分析軟件GENECUBE-TCGS操作說明，設置PCR擴增反應以及檢出參數如下：待機溫度 35 ℃，預變性94 ℃ 30 s，變性 97 ℃ 1 s，退火 60 ℃ 3 s，延伸63 ℃ 5 s，待機溫度 35 ℃（變性-延伸的循環次數均為50次）。檢出參數：94 ℃ 30 s，39 ℃ 30 s，40～75 ℃，溫度上升速度為0.09 ℃/s。

1.2.3 檢測結果判讀 熒光微分值≥10，且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在50～60 ℃，提示Hp菌群陽性及23S rRNA基因2142和2143位點無突變；熒光微分值≥10，且熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42～50 ℃，提示Hp菌群陽性及23S rRNA基因2142或2143位點有突變；熒光微分值＜10，內部質控熒光微分值≥1.0，且其熔解曲線峰值所在的熔解溫度在42～68 ℃，提示Hp菌群陰性。

1.2.4 DNA測序方法 直接檢測樣本Hp及耐藥基因，參考DNAiso試劑盒說明書抽取胃黏膜組織勻漿中的DNA，針對克拉霉素耐藥Hp基因23S rRNA的核酸序列設計用于PCR的引物，在NCBI中查找參考序列，使用軟件Primer Premier 3.0進行設計引物（由深圳華大基因股份有限公司合成），Hp 23S rRNA 上游引物A2142+A2143-F，5'-TTACCAAAAACACAGCA-3'；Hp23S r R N A 下游引物A 2 1 4 2+A 2 1 4 3-R，5'-CTCCATAAGAGCCAAAG-3' PCR擴增反應的反應體系50 μL為：10×反應緩沖液5 μL 、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq 0.25 μL、模板1 μL 和無菌雙蒸水37.75 μL。PCR反應條件為： 96 ℃，預變性5 min；95 ℃，變性20 s； 52 ℃退火45 s；72 ℃延伸60 s， 共45個循環。PCR擴增產物的純化和測序，交由深圳華大基因股份有限公司完 成。

1.2.5 統計學方法 將資料和結果使用Excel建立數據庫，應用SPSS 20.0統計軟件，使用卡方檢驗分析不同年齡段、性別、病種類型對Hp 23S rRNA第2142或2143位點變異的影響，當P＜0.05表示兩者差異有統計學意義。總結兩種試驗方法的定性檢測結果，計算陽性符合率、陰性符合率和總符合率，并對定性檢測結果進行Kappa檢驗以驗證兩種方法結果的一致性。Kappa值≥0.75表示兩者一致性較好[4]。

2 結果

2.1 基本資料

本研究中，提供80份胃黏膜組織的患者年齡17～83歲，平均（53.6±13.9）歲；其中男40例，女40例。檢測Hp陽性患者臨床診斷包括慢性淺表性胃炎35例、慢性萎縮性胃炎21例、慢性糜爛性胃炎4例、胃潰瘍6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1 例。

2.2 熒光PCR熔解曲線法檢測結果

使用熒光PCR熔解曲線法對80份快速尿素酶試驗Hp陽性患者的胃黏膜組織標本進行檢測，共69份樣本Hp陽性，11份Hp陰性，陽性率為86.2%。在69份Hp陽性的標本中24份標本存在23S rRNA第2142或2143位點的變異（突變株），45份標本未檢測到位點突變（野生株），突變率占34.8%。本次試驗中男性患者組和女性患者組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點突變率分別為29.4%（10/34）和40.0%（14/35），差異無統計學意義（P=0.356）。

Hp陽性患者按年齡分為老年（≥60歲）和非老年（17～59歲）兩組。結果顯示老年組和非老年組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點突變率分別為36.4%（8/22）和34.0%（16/47），差異無統計學意義（P=0.850）。

Hp陽性患者按照不同消化道疾病分為慢性淺表性胃炎組35例、慢性萎縮性胃炎組25例（包括慢性萎縮性胃炎21例和慢性糜爛性胃炎4例）和潰瘍組9例（包括胃潰瘍6例、胃癌2例和胃黏膜息肉1例）。結果顯示淺表性胃炎組、萎縮性胃炎組和潰瘍組的Hp 23S rRNA第2142或2143位點突變率分別為34.3%（12/35）、36.0%（9/25）和33.3%（3/9），差異無統計學意義（P=0.986）。

2.3 DNA測序結果

80份快速尿素酶試驗Hp陽性患者的胃黏膜組織標本使用DNA測序法共檢測64份Hp陽性，16份Hp陰性，陽性率為80.0%。在64份Hp陽性的標本中23份標本檢測到23S rDNA耐藥基因的突變，41份標本沒有檢測到基因突變，突變率35.9%。23株Hp突變株均為單位點突變，其中2142位點突變率為0，2143位點突變率為100%，19株為2143位點GG突變型，4株為2143位點AG雜合型。Hp野生型、雜合型和突變型的DNA核苷酸序列檢測結果見表1。

表1 Hp野生型、雜合型和突變型的DNA核苷酸序列檢測結果Table 1 DNA nucleotide sequencing results in wild-type, heterozygous, and mutant H. pylori

2.4 兩種方法對Hp核酸的有效檢測一致性評價

兩種方法陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為100%、68.8%和92.5%，Kappa系數為0.779。

2.5 兩種方法對Hp耐藥基因突變的一致性評價

本實驗使用兩種方法共同檢測64份陽性樣本Hp 23S rRNA第2142或2143位點突變。其中熒光PCR熔解曲線法檢測Hp耐藥基因突變株22例，野生株42例。DNA測序法檢測Hp耐藥基因突變株23例，野生株41例。陽性符合率、陰性符合率和總符合率分別為87.0%、95.1%和92.2%，Kappa系數為0.829。

3 討論

2017年中華醫學會消化病學分會發布的抗Hp感染共識中推薦使用經典鉍劑四聯根治方案[5]。然而在實際應用中，四環素和呋喃唑酮藥物不良反應風險較大且難以廣泛獲得；甲硝唑耐藥率高，于2017年被世界衛生組織列為2B類致癌物，因此克拉霉素被廣泛推薦用于Hp根除治療的一線方案[6]。但隨著我國克拉霉素在抗感染等領域的廣泛使用，Hp對其敏感率逐年下降，這成為含克拉霉素根除治療方案失敗的重要原因。Sun等[7]研究結果顯示上海地區Hp對克拉霉素的耐藥率從2000年8.6%上升到2005年9.0%再上升到2009年20.7%。國內另一項研究結果顯示北京地區Hp對克拉霉素的耐藥率從2000年14.8%上升到2009年65.4%[8]。因此在選擇治療方案前，先檢測Hp是否對克拉霉素耐藥，對于提高Hp根除率具有重要作用。

近年來國內外學者對Hp 23S rRNA耐藥基因的突變進行大量研究發現，Hp對克拉霉素耐藥主要與2142和2143位點的核苷酸A突變成G有關，最常見的是A2143G占69.8%，其次是A2142G占11.7%和A2142C占2.6%[9]。李曉芳等[10]對2017年成都地區分離的24株耐克拉霉素的Hp研究顯示所有耐藥株都在23S rRNA基因功能V區發生了A2143G的突變，突變率為100%。孫婷等[11]對2017年浙江地區分離127株Hp進行23S rRNA基因突變篩查結果顯示，主要突變為A2143G，突變頻率42.5%（54/127）， 其次為A2142G基因型突變2.4%（3/127）。但是也有研究顯示Hp耐藥株的遺傳學特征存在明顯地域差異，因此獲得本地區Hp對克拉霉素耐藥性的結果，對于臨床選擇最佳的根除方法極為重要。

本實驗采用的熒光PCR熔解曲線法是目前國內首次采用KOD-DNA聚合酶用于PCR來進行Hp檢測。KOD-DNA聚合酶來源于超嗜熱古菌（Thermococcus kodakaraensis），與目前市場上PCR反應體系常用的Taq DNA聚合酶比較，其耐熱性是傳統Taq DNA聚合酶的7倍，合成速度是其2.5倍。使用KOD-DNA聚合酶可以在45 min內完成整個PCR，大大縮短了目前傳統PCR方法所需要的4～6 h的檢測時間，極大提高了檢測效率。此外本實驗還采用quenching-probe技術設計熒光探針，使探針序列縮短到16 bp左右，在68～70 ℃時就能與靶序列特異退火，更短的序列可降低堿基不匹配的概率，從而提高方法的靈敏度。

本實驗通過熒光PCR熔解曲線法和DNA測序法對臨床組織標本直接檢測Hp對克拉霉素耐藥位點突變，探尋兩種檢測方法對耐克拉霉素Hp之間的符合率，采用熒光PCR熔解曲線法直接對80份胃黏膜組織標本進行檢測，其中69份樣本Hp陽性，陽性為86.2%。在69份Hp陽性的標本中24例標本存在23S rRNA第2142或2143位點的突變，突變率為34.8%。使用DNA測序方法對23株Hp突變株進行突變位點檢測，其中2142位點突變率為0，2143位點突變率為100%，19株為2143位點GG突變型，4株為2143位點AG雜合型，這與梁曉等[12]報道的上海地區Hp克拉霉素耐藥株主要以A2143G突變為主（97.1%）結果一致。以DNA測序法與熒光PCR熔解曲線方法對于Hp特異性序列檢測結果的一致性（Kappa）為0.779，兩者一致性較好；對于Hp23S rRNA第2142或2143位點突變檢測結果的一致性（Kappa）為0.829，兩者一致性較 好。

綜上所述，上海地區克拉霉素耐藥Hp菌株基因型以23S rRNA基因的A2143G突變占主導地位，23S rRNA點突變的檢測可以為臨床分析Hp對克拉霉素的耐藥性提供重要的參考依據。熒光PCR熔解曲線法可直接檢測胃黏膜活檢組織中Hp及其23S rRNA突變基因，該方法耗時短且結果可靠，為臨床快速、簡便的檢測Hp對克拉霉素耐藥性提供一種行之有效的解決方案。