黃芪多糖對骨骼肌成肌細胞增殖作用的研究

鄧聰 ，楊志敏，徐福平 ，孫玉姣，陳玉狀，賴艷嫻，岑美婷

(1.廣州市第一人民醫院南沙醫院，廣東 廣州 511457；2.廣州中醫藥大學第二臨床醫學院，廣東 廣州 510120)

衰老對所有生物而言都是不可避免的，社會人口老齡化已是各國面臨的嚴峻問題。據2011～2015年統計，我國≥60歲老年人口比重由13.3%增加到16%，并以每年3%的速度增長，是同期其他人口增長速度的5倍[1]。隨著年齡的增長，機體的骨骼肌質量也隨之減少，主要表現為肌肉體積、橫斷面積以及肌纖維數量的變少，出現老年性骨骼肌減少癥，又稱肌肉減少癥(Sarcopenia)。肌肉減少癥是衰老過程中發生的主要變化[2]，因此，從骨骼肌萎縮角度研究人體衰老的防治具有重要意義[3]。黃芪具有益氣生肌的作用，廣泛用于各補益類方劑中，黃芪多糖(Astragalus polysaccharides，APS)是其主要生物活性成分之一。現代藥理研究發現，黃芪有良好的抗氧化、增強免疫、抗衰老等作用[4]。本實驗通過研究APS對骨骼肌成肌細胞的增殖作用，為課題組的進一步研究提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠C2C12骨骼肌細胞(中科院細胞庫)；APS(美國泛華生物公司)；新生胎牛血清(四季青生物工程研究所)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司)；地塞米松、MTT(Sigma公司)。

1.2 細胞制備

C2C12骨骼肌細胞用含10%新生胎牛血清的DMEM高糖培養基培養(37℃，5% CO2，95%濕度)，觀察細胞肌管分化情況，以兩核以上呈串珠樣的肌管達80%以上為肌管分化成功。

1.3 實驗分組

將分化成功的C2C12骨骼肌成肌細胞(以下稱成肌細胞)以5×104個/mL密度接種于96孔培養板，每實驗組6個復孔，待細胞貼壁后，按APS不同濃度分為0.1、0.2、0.4、0.8和1 mg/mL 5組；按DEX不同濃度分為1、10、100和1 000 μM 4組，并設正常對照組。培養12 h、24 h。根據上述實驗結果選取有統計學意義的APS、DEX濃度，再分為3組進行干預實驗(DEX組、DEX+APS組、正常對照組)培養24 h。

1.4 成肌細胞增殖率和抑制率

用MTT法檢測，將每孔的上清吸棄，分別加入50 μL MTT，放置于37 ℃溫育4 h，然后吸棄上清，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，在酶標儀上用570 nm波長測各孔OD值。并設調零孔。

細胞增殖率(%)=(實驗組OD值-調零組OD值)/(對照組OD值-調零組OD值)×100%

細胞抑制率(%)=(1-細胞增殖率)×100%

1.5 成肌細胞肌管橫徑

成肌細胞用玻片培養，甲醛固定，HE染色，用200倍光鏡隨機依次選取左上、右上、左下、右下和中間5個視野進行觀察，結果用Image Pro-Plus 6.0軟件分析。橫徑為細胞核到肌管邊緣的最短距離。

1.6 成肌細胞凋亡率

用AnnexinV-FITC凋亡試劑盒檢測。胰酶消化細胞后，PBS洗滌2次，計數取1×106個/mL細胞，加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶，避光孵育10 min，流式細胞儀檢測。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 APS對成肌細胞增殖的影響

兩時間段OD值，除0.8 mg/mL APS組外，其余APS濃度組與對照組比較均有統計學差異(P<0.05)。兩時間段增殖率，與對照組比較，APS分別為0.1、0.2、0.4、0.6 mg/mL時增殖率均升高(P<0.05)；APS為0.8 mg/mL時無統計學差異(P>0.05)；APS為1 mg/mL時增殖率下降(P<0.05)。結果見圖1和圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖1 不同濃度APS對成肌細胞OD值的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。圖2 不同濃度APS對成肌細胞增殖率的影響

2.2 DEX對成肌細胞抑制的影響

與兩個時間段對照組比較，DEX為100、1 000 μM時OD值均降低而抑制率均升高(P<0.05)；DEX為10 μM時OD值及抑制率，24 h時有統計學差異(P<0.05)，12 h時無統計學差異(P>0.05)；DEX為1μM時無統計學差異(P>0.05)。結果見圖3和圖4。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖3 不同濃度DEX對成肌細胞OD值的影響

注：與對照組比較，*P<0.05。圖4 不同濃度DEX對成肌細胞抑制率的影響

2.3 各組成肌細胞OD值和成肌細胞肌管橫徑的比較

根據上述實驗統計結果，選取APS 0.2 mg/mL，DEX 100 μM為干預濃度。與對照組OD值比較，12 h內DEX組、APS+DEX組及24 h內DEX組均有統計學差異(P<0.05)，24h內APS+DEX組無統計學差異(P>0.05)。

與對照組比較，DEX組肌管橫徑下降(P<0.05)，APS+DEX組無差異(P>0.05)。APS+DEX組與DEX組肌管橫徑比較有統計學差異(P<0.05)。結果見表1。

2.4 各組對成肌細胞凋亡率的比較

與對照組比較，DEX組和APS+DEX組細胞凋亡率均上升(P<0.05)。APS+DEX組和DEX組比較有統計學差異(P<0.05)。結果見表1和圖5。

3 討論

衰老是一個綜合表現，包括身體、認知及精神等方面。人體的肌肉骨骼系統，如肌肉、骨頭和關節等均受到衰老的影響，萎縮的骨骼肌會影響身體機能[5]。肌肉減少癥是一種以老年人骨骼肌質量、肌量、功能下降為主要表現的病癥。隨著機體年齡增長，骨骼肌的結構和功能也發生退變，從而加速了神經系統、心血管系統以及其他組織器官的衰老[6]。研究已證實肌肉減少癥與不良結局相關，如跌倒、殘疾、住院、長期護理、生活質量變差和死亡率等，這些都表明防治肌肉減少癥對老年人保健的重要性[2]。

表1 各組成肌細胞OD值、凋亡率、肌管橫徑的比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與DEX組比較，#P<0.05。

圖5 各組凋亡圖

目前體育鍛煉和營養支持被認為是預防和治療與年齡相關的肌肉異常的基礎[7],但缺乏有效的治療方法[8]。肌肉減少癥可歸屬于中醫學“虛弱”“痿證”等范疇，以年老體弱，脾腎氣虛為主要病機，而益氣健脾、補養后天是關鍵。補氣藥黃芪見于各經典補益方中，具有補氣生肌、固表、托毒排膿等功效。APS是黃芪的主要活性成分，含量高達50%以上。本實驗發現，APS對正常成肌細胞有良好的增殖作用。在0.6 mg/mL濃度以下增殖率顯著提高，并在0.2 mg/mL達到峰值，提示0.2 mg/mL是APS的最佳實驗濃度，而在0.8 mg/mL之后則出現抑制，這可能與濃度過高產生細胞毒性有關。

成肌細胞萎縮模型的建立，動物模型主要通過去神經或代謝營養等因素實現，細胞模型則主要通過化學或生物制劑干預，如TNF-α、DEX和睪丸酮等。研究表明,在誘導C2C12肌管萎縮時，DEX的效果可能更優[9]。本實驗結果顯示，100 μM以上濃度的DEX對成肌細胞有顯著的抑制作用，24 h抑制率分別為100 μM 38%、1 000 μM 54%，本實驗選取100 μM濃度進行成肌細胞萎縮模型造模。在給予0.2 mg/mL APS干預24 h后，細胞OD值和肌管橫徑均升高(P<0.05)，凋亡率下降(P<0.05)，提示APS對防治肌肉減少癥有一定的作用，但具體的機制有待下一步的研究。