白芷提取物對大腸癌荷瘤裸鼠模型抗腫瘤和免疫調節作用的研究

李大宇，滕萍英

(桂林醫學院，廣西 桂林 541000)

大腸癌(Colorectal cancer)是常見的惡性腫瘤，發病年齡趨老年化，男女比為1.65∶1。 在西方發達國家，其發病率位在各類型腫瘤中居第二位[1]。在中國，大腸癌在所有腫瘤發病率中排名第5位，而且上升趨勢明顯。全球每年大約102萬新發病例，53萬死亡病例[2]，其中我國每年新發病人數約40萬人，死亡為7.35/10。針對大腸癌的化療藥物主要包括卡培他濱、氟尿嘧啶(5-FU)、伊立替康、亞葉酸(leucovorin)、奧沙利鉑和UFT[3]，有時也使用表皮生長因子受體抑制劑[4]。5-氟尿嘧啶(5-FU)一直是全身細胞毒性化療的基石[5],廣泛應用于臨床，但是約1/3接受5-FU治療的患者會出現客觀的反應和黏膜炎、腹瀉、骨髓抑制等毒性作用[6],并且出現了耐藥特性[7]。因此，當前需要開發新的藥物或者聯合用藥以治療大腸癌患者。在天然產物中尋找高效、低毒并且能提高患者順應性的治療藥物是新藥研發的著眼點。白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch．ex Hofhn．) Ben th．et Hook．F．]或杭白芷[A.dahurica(Fisch．ex Hoffm．)Benth．et Hook．F．var． Formosana (Boiss．)Shan et Yuan]的干燥根，始載于《神農本草經》，列為中品, 性辛溫，入肺、胃經，具有散風除濕、通竅止痛、消腫排膿、生肌的作用。用于感冒頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶、瘡瘍腫痛、白癜風以及牛皮癬等。目前從白芷中分離鑒定出香豆素及其衍生物55種[8]、揮發油類111種[9]、苷類成分9種[10-13]以及其他成分如白芷毒素(angelicotoxin)[14]、微量元素等。現代藥理研究證實，白芷具有抗炎鎮痛、抑制病原微生物、清除自由基、抗腫瘤、保肝以及美白等多種藥理活性。其中香豆素類成分——戊烯氧呋喃豆素和異歐前胡素[15]、異歐芹屬素乙、蛇床素、氧化前胡內酯、白當歸腦、水合羥基前胡素[16]等對宮頸癌HeLa細胞株和肺癌A549細胞株、卵巢癌SK-OV-3細胞株和結腸癌HCT-15C細胞株等有明顯的細胞毒作用。可見白芷的抗腫瘤藥理特性具備充分的研究基礎。本實驗使用白芷提取物通過大腸癌CT-26細胞株荷瘤裸鼠模型，測定白芷提取物(AD-2P)與5-FU、leucovorin(LV)聯合用藥的治療效果，觀察其在荷瘤小鼠體內的抗腫瘤情況，檢測AD-2P對巨噬細胞的免疫調節作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

酶聯免疫檢測儀(authos 2010 17750, Austria)；血清分析儀(Roche cobas c111)；血液分析儀(HORIBA&，LC 660)；CO2培養箱(SANYO,Japan)；低溫高速離心機(TOYM, Japan)；Tecan Infinite F200 micro-plate reader(Tecan, Mannedorf，Switzerland)；10%胎牛血清(FBS; Gibco, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)；Trypsin-EDTA (Gibco, Franklin Lakes, NJ, U.S.A.)；青霉素-鏈霉素(Sigma St.Louis, MO, USA)；脂多糖(LPS，Sigma St. Louis, MO,USA)；5-氟尿嘧啶(5-FU)、亞葉酸(LV)(上海斯信生物科技)；白芷提取組分(AD-2P)為白芷水煎濃縮物使用大孔樹脂柱在20%甲醇洗脫梯度下得到的流分，經濃縮，再使用冷75%乙醇溶液溶解后取得的沉降物； 裸鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)檢測試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)；兔抗ERK1/2、兔抗JNK、P38 MAPK抗體(小鼠單抗)(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.1.2 實驗動物與腫瘤株

小鼠巨噬細胞株RAW264.7和大腸癌細胞株CT26購自ATCC(American Type Culture Collection, Rockville,MD)；SPF級BALB/c裸鼠,6周齡,體質量(20±2)g,購自美國ORIENT公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 CT26細胞株荷瘤裸鼠模型構建

BALB/c裸鼠,6周齡,體質量(20±2)g，雌雄各半，在動物實驗中心恒溫25℃～27℃、恒濕45%～50%、新鮮空氣、除塵除菌的無特殊病原菌(SPF級)飼養室條件下，飼養純化1周后，取相近體質量約22 g小鼠分為正常組(無細胞移植組)、生理鹽水組(control組)、5FU組、5FU+LV組、白芷提取物組、5FU+白芷提取物組和5FU+LV+白芷提取物組，每組10只。CT26細胞(2×105/100 μL DMEM培養液)皮下注射于BALB/c裸鼠的左前肢，腫瘤培育生長14天，體積達到約32 mm3[腫瘤體積mm3=(W1× W1×W2)×π/6，其中W1和W2分別為最大和最小的腫瘤直徑(mm)]時進行試驗。

1.2.2 給藥方法

細胞移植建模后第15天，將(AD-2P)與5-FU，LV組合，通過灌胃及腹腔注射途徑，觀測各組的體質量變化和腫瘤生長情況。生理鹽水組(Control組)按0.02 ml/(g·d)灌胃、5FU組單次腹腔注射90 mg/kg、5FU+LV組單次腹腔注射劑量分別為90 mg/kg+100 mg/kg、(AD-2P)組按500 mg/(kg·d)灌胃、5FU+(AD-2P)組單次腹腔注射90 mg/kg+500 mg/(kg·d)灌胃、5FU+LV+(AD-2P)組單次腹腔注射90 mg/kg+100 mg/kg+500 mg/(kg·d)灌胃和單次腹腔注射90 mg/kg+100 mg/kg+100 mg/(kg·d)灌胃兩組。

1.3 測定方法

1.3.1 小鼠體征、腫瘤及血液情況測定

給藥14天期間，每日相同時間段內測量各組小鼠的體質量和腫瘤大小，觀察小鼠體質變化。第15天，乙醚麻醉，從腹帶動脈取血，檢驗血液指標(紅細胞、血紅蛋白、白細胞計數和血小板計數等)；取部分全血凝固30 min后，圓心分離(3 000 rpm，15min)獲得血清，檢測ALT、AST數值；取小鼠肝臟、脾臟和胸腺，稱重。

1.3.2 ELASA法檢測AD-2P對巨噬細胞株的細胞因子分泌影響

RAW264.7細胞培養于DMEM培養基(dulbecco's modified eagle medium), 添加10%胎牛血清(FBS)、青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)。RAW264.7細胞(5×105cell/mL)在平底96孔微量滴定板中培養12 h，一式四份。此后，用AD-2P(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL)、LPS(0.1 μg/mL)、多粘菌素(PMB，10 μg/mL)等組合處理的新鮮培養基替換100 μL培養基，并繼續培養24 h。在培養結束時收集培養上清液，測定產生一氧化氮(NO)、TNF-α的表達水平；具體步驟參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.3.3 Western blot法檢測AD-2P在MAPK通路的蛋白表達

RAW 264.7細胞培養基內，加入LPS(0.1 μg/mL)孵育30 min、AD-2P(0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL)孵育30 min后，收集細胞溶解液，提取總蛋白。RAW 264.7細胞培養基內，加入LPS(0.1 μg/mL)孵育30 min、AD-2P(5 μg/mL)分別孵育15 min、30 min、45 min和60 min后，收集細胞溶解液，提取總蛋白。用蛋白質印跡法測定MAPK磷酸化的表達水平。兔抗ERK1/2、兔抗JNK、P38 MAPK抗體(小鼠單抗)參照試劑說明書進行。

1.4 統計學處理

應用SPSS19.0統計軟件，對各配伍組合的組間比較，采用T-檢驗以及方差分析法。P≤0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 CT26荷瘤裸鼠一般狀況觀察

CT26細胞(2×105/100 μL DMEM培養液)皮下注射于BALB/c裸鼠的左前肢接種后，所有裸鼠均建模成功。每天給藥后觀察，小鼠精神狀態良好，活動與進食正常。伴隨時間變化，左腋下瘤體逐漸增大，大部分小鼠出現一定程度的活動不便，但不影響進食。至給藥14天結束，所有小鼠均存活。

2.2 各給藥組對CT26荷瘤裸鼠的抗腫瘤效果

分別使用濃度為500 mg/kg的AD-2P灌胃、5-Fu(90 mg/mL)腹腔注射和LV(100 mg/mL)腹腔注射等聯合治療小鼠大腸癌CT26細胞接種移植的BALB/C小鼠，觀察AD-2P在裸鼠體內治療效果。藥物處理第15天，各組小鼠稱重、測瘤體積后，麻醉取血、手術摘除組織器官、剝離瘤體稱重。AD-2P、5-Fu和LV等聯合給藥組合，對腫瘤生長的影響如圖1所示。 AD-2P協同5-Fu和LV治療組抑制小鼠腫瘤的生長，有顯著差異(P<0.05)。5-FU和LV組治療組抑制小鼠腫瘤的生長效果最強，有顯著差異(P<0.01)(圖1A)；取組織器官肝、脾、胸腺和瘤體稱重后發現，5-Fu和LV治療組的瘤體平均重量為1.39 g，AD-2P協同5-Fu和LV治療組的小鼠瘤體平均重量為1.58 g。兩組小鼠的瘤重顯著低于其他組別，在瘤體重量相近的狀況下，AD-2P協同治療組小鼠的體質量明顯高于5-Fu、LV組(圖1B)，同時胸腺增重明顯，其他無明顯差異。

2.3 AD-2P對LPS刺激的RAW264.7細胞的一氧化氮(NO)與TNF-α產物的分泌影響

巨噬細胞株RAW264.7細胞用不同濃度的AD-2P(10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL)、LPS(0.1 μg/mL)、多粘菌素(PMB，10 μg/mL)等組合處理24 h后，收集培養上清液，用ELISA方法檢測NO和TNF-α分泌情況。結果如圖2所示， AD-2P(10 μg/mL)以及濃度更高時，可促進RAW264.7細胞的NO分泌量， 與media空白組相比有顯著差異(P<0.05)，呈現劑量依賴關系；AD-2P(10 μg/mL)以及濃度更高時，可促進TNF-α分泌量，與media空白組相比有顯著差異(P<0.05)，呈現劑量依賴關系。

圖1 給藥組對CT26荷瘤裸鼠腫瘤的影響和體質量變化

圖2 AD-2P對RAW264.7細胞的一氧化氮(NO)、TNF-α分泌影響

2.4 AD-2P對RAW264.7細胞在MAPK通路的蛋白表達影響

Western blot檢測結果顯示(圖3)，AD-2P在不同劑量梯度下，對RAW264.7細胞的MAPK通路ERK1/2、JNK與P38的磷酸化活化產物P-ERK1/2、P-JNK和P-P38的蛋白表達量增加，且呈劑量依賴關系，ERK、JNK與P38蛋白比較無顯著差異(P>0.05)(圖3A)；使用AD-2P(5 μg/mL)分別孵育不同時間，獲取蛋白檢測結果顯示， P-ERK在孵育30 min、45 min和60 min的蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，P-JNK、P-P38的蛋白表達有增加，但無顯著性差異(P>0.05)； ERK1/2、JNK及P38等蛋白表達無顯著性差異(圖3B)。

圖3 AD-2P對RAW 264.7細胞MAPK通路下的蛋白表達

3 討論

癌癥是威脅人類健康問題的主要殺手，其發生率和死亡率呈逐年上升的趨勢。化療和放療等方法在廣泛應用的同時，出現了耐藥性和毒副作用，極大降低了患者的生存質量。我國擁有豐富的中草藥資源，在中草藥中尋找有效、低毒的抗腫瘤藥物，來改善腫瘤患者的長期生活質量，是藥物研究的重要方向。白芷是我國常用的傳統中藥材，功效主要是散風除濕、通竅止痛、消腫排膿。現代藥理學研究發現，白芷具有抗菌抗炎、解熱平喘、降低血壓和抗腫瘤等作用。本實驗在研究初期發現白芷水煎劑在抗大腸癌小鼠模型中展現了良好的抗腫瘤效果，繼而分離出AD-2P組分進行了進一步的抗腫瘤實驗，并研究了該組分體外在RAW 264.7細胞的免疫調節作用。

在CT26細胞株荷瘤裸鼠模型中，AD-2P協同5-FU和LV治療組，在灌胃14天后，與對照組(Control)相比，表現了一定的抗腫瘤作用。雖然對比5-FU和LV治療組，抑瘤效果不足，但在小鼠體質量恢復上表現良好，小鼠生存狀態優良。檢測組織器官肝臟、脾臟無明顯變化，中樞免疫器官胸腺略有增大，此現象將AD-2P的抗腫瘤機制導向其免疫調節作用。

NO是一種重要的生物活性物質，除了在中樞神經系統中作為重要的信息傳遞物質外，還廣泛參與包括免疫反應在內的機體多系統的生理和病理過程[17-19]。當巨噬細胞收到刺激活化后，釋放大量的NO，具有細胞毒作用，可殺傷微生物(細菌、真菌、病毒)、寄生蟲和腫瘤細胞等[20]。在體外實驗中，AD-2P可顯著增加RAW264.7細胞的NO產物的分泌。提示AD-2P是巨噬細胞免疫調節物質。細胞因子TNF-α與NF-κB的信號通路有關，具有良好的抗腫瘤作用和多種免疫調節功能。AD-2P(10 μg/mL～500 μg/mL)隨著濃度劑量的加大， TNF-α的生成，與media空白組相比產生顯著差異(P<0.05)，且呈現劑量依賴關系。提示AD-2P可能通過激活NF-κB的信號通路，導致增加TNF-α分泌量，增加細胞免疫功能。

MAPK是介導巨噬細胞活化的和炎癥基因表達的TLR4(Toll-like receptor 4)信號途徑的重要下游信號分子。Western blot實驗中，經不同濃度的AD-2P作用后，對RAW264.7細胞的MAPK通路ERK1/2、JNK與P38的磷酸化活化產物P-ERK1/2、P-JNK和P-P38的蛋白表達量增加(P<0.05)，并呈梯度依賴。時間依賴試驗中，P-ERK蛋白表達量顯著增加(P<0.05)，P-JNK和P-P38的蛋白表達也有一定增加。提示AD-2P對MAPK的3個亞群ERK1/2、JNK、P38均發生磷酸化而活化，可能具有激活MAPK通路的作用。

綜上所述，AD-2P可能通過增加NO和TNF-α產物，激活MAPK通路的ERK1/2、JNK和P38蛋白表達發揮免疫調節作用，從而抑制大腸癌瘤體的增長，為進一步研究開發新的抗腫瘤藥物提供了可能。