七氟醚后處理對失血性休克復蘇大鼠海馬氧化應激及SIRT1/PGC-1α表達的影響

王妍妍，張 麗，黃春霞，朱守峰，楊青青，胡憲文

(安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，安徽 合肥 230601)

失血性休克是臨床常見的危重癥之一，再灌注策略是治療失血性休克的基本方法，但液體復蘇的同時可能會加重缺血組織的功能障礙，誘發缺血/再灌注損傷。腦組織，尤其是海馬組織，對缺血缺氧更加敏感，也更易發生缺血/再灌注損傷，而氧化應激是腦缺血/再灌注損傷發生、發展過程中重要的一環[1]。

七氟醚是一種揮發性吸入全身麻醉藥物，我們前期的研究表明，七氟醚后處理可通過減輕海馬CA1區膽堿能神經元損傷，從而改善缺血/再灌注大鼠空間學習與記憶能力[2]。然而，七氟醚后處理對失血性休克復蘇大鼠海馬氧化應激的影響尚未可知。有研究表明，上調沉默信息調節因子1 (silent information regulation 1，SIRT1)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)蛋白的表達，可減輕氧化應激反應和線粒體功能障礙[3]。本實驗擬研究七氟醚后處理對失血性休克復蘇大鼠海馬氧化應激及抗氧化應激相關蛋白SIRT1和PGC-1α表達的影響，以探討七氟醚后處理發揮腦保護作用的初步分子機制，為臨床預防和治療腦缺血/再灌注損傷提供新的思路和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康成年♂ SD大鼠，清潔級，體質量(300～350) g，由安徽醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(皖)2005-001。自由進食飲水,保持動物房內溫度(20～25) ℃，濕度50%～55%,黑暗和光照各12 h。

1.1.2試劑 七氟醚(貨號：83291)，購自艾伯維公司；線粒體提取試劑盒(貨號：GMS10006.2)，購自美國GENMED公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒(貨號：A001-3)，購自南京建成生物工程研究所；丙二醛(malonaldehyde，MDA)檢測試劑盒(貨號：S0131)、RIPA裂解液(貨號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：P0012)，購自碧云天生物技術有限公司；β-actin單克隆抗體(貨號：66009-I-Ig)、PGC-1α單克隆抗體(貨號：66369-I-Ig)，均購自Proteintech公司；SIRT1單克隆抗體(貨號：9475S)，購自美國Cell Signaling Technology公司；ECL顯影液(貨號：34095)，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.3儀器 雙向全自動輸液泵(美國Genie Touch公司)；生物機能系統(上海奧爾科特生物科技有限公司)；氣體監測儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司)；七氟醚揮發罐(Grager公司)；多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組 將大鼠按隨機數據表法分為3組(每組12只)：假手術組(Sham 組)、失血性休克復蘇組(Shock組)、七氟醚后處理組(Sevo 組)。

1.2.2大鼠失血性休克復蘇模型的制備 模型制備前，大鼠適應性喂養7 d，術前禁食8～12 h，可自由飲水。稱重后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)麻醉，仰臥位固定于實驗臺，經口氣管內插管，保持自主呼吸。消毒后，取頸正中切口，分離出右頸總動脈和左頸靜脈后，分別向近心端置入PE50管，連接三通后連接生物機能系統，監測平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)。通過頸靜脈輸注肝素500 U·kg-1，觀察10 min后，利用雙向全自動輸液泵經右頸總動脈持續勻速抽血30 min，抽出的血液存儲于無菌10 mL注射器中，抽血量為大鼠總血容量的40%。抽血結束后1 h，于30 min內經左頸靜脈回輸全部抽血量，建立失血性休克復蘇模型。Sham組動靜脈置管等手術操作同Shock組，但不放血。

1.2.3七氟醚后處理 參照文獻[4]介紹的方法實施七氟醚后處理。將即將接受血液回輸的大鼠置于自制半密閉有機玻璃容器(30 cm×20 cm×20 cm)內，容器相對的兩面各留一直徑約2 cm的圓孔,分別作為進氣孔和出氣孔。出氣孔接呼氣末麻醉藥濃度監測儀，持續監測七氟醚、O2及CO2的濃度。容器底部鋪上適量鈉石灰，利用(95% O2，5% CO2)混合氣體帶動七氟醚通過進氣孔進入有機玻璃容器內，調節七氟醚揮發罐，使七氟醚呼氣末濃度達到2.4%，并維持30 min。Sham組和Shock組在相應時間點被放入容器內，吸入95% O2，5% CO2混合氣30 min。

1.2.4MAP的監測 監測并記錄放血即刻(T0)、放血結束即刻(T1)、血液回輸即刻(T2)和血液回輸結束即刻(T3)三組的MAP。

1.2.5血氣分析 在上述T0、T1、T2、T3時間點，取0.2 mL動脈血進行血氣分析，記錄血pH值、堿剩余(base excess,BE)和乳酸(Lac)濃度。從動脈抽取0.2 mL血的同時，經靜脈輸注0.2 mL生理鹽水，以作補充。

1.2.6海馬線粒體的提取 自體血回輸24 h后，各組隨機選取6只大鼠，按50 mg·kg-1劑量腹腔注射3%戊巴比妥鈉，迅速斷頭取腦，分離出海馬組織。稱重后剪碎，加入按照線粒體分離試劑盒說明書配制的海馬線粒體裂解液，研磨后，將混合物置于1.5 mL EP管中，4 ℃、1 500×g離心10 min后取上清，10 000×g離心10 min,棄上清，所得沉淀即為線粒體，加入儲存液，重懸混勻后，置于4 ℃冰上待用。

1.2.7海馬線粒體SOD活性檢測 取上述提取的海馬線粒體，利用BCA試劑盒測定線粒體蛋白濃度后，根據SOD測定試劑盒說明書，依次加樣對照孔、對照空白孔、測定孔、測定空白孔，37 ℃孵育20 min,測定各孔在450 nm處的吸光度，再根據相應公式計算出相應線粒體樣品的SOD活性。

1.2.8海馬組織MDA含量測定 自體血回輸結束24 h后,取各組剩余的6只大鼠的海馬組織，保存于-80 ℃冰箱備用。將適量海馬組織剪碎后，置于玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解液，研磨充分后冰浴30 min;混合物4 ℃、13 200 r·min-1離心30 min后，取上清。留部分上清做BCA蛋白定量，剩下部分上清液依據MDA檢測試劑盒說明書，基于MDA和硫代巴比妥酸反應產生紅色產物的顯色反應，通過比色法，用酶標儀分別測定不同濃度標準品和各樣品在532 nm的吸光度，計算各樣品中的MDA含量。

1.2.9Western blot法檢測SIRT1和PGC-1α蛋白的表達 取上述提取的剩余各組海馬組織蛋白，加入上樣緩沖液，100 ℃變性10 min,保存于-20 ℃。取蛋白進行8% SDS-PAGE電泳分離，并轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗滌后，分別加入β-actin一抗(稀釋度1∶10 000)、SIRT1一抗(稀釋度1∶1 000)、PGC-1α一抗(稀釋度1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。次日TBST洗滌，用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，在暗室進行ECL顯影。采用凝膠成像系統拍照，通過Image J軟件測定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，反映目的蛋白的相對表達水平。

2 結果

2.1 各組不同時間點MAP的變化如Tab 1所示，T0時和T3時3組大鼠MAP比較無明顯差異(P>0.05)；與Sham組比較，Shock組和Sevo組在T1和T2時MAP降低(P<0.05)。

Tab 1 MAP during hemorrhagic shock and resuscitation

2.2 各組動脈血氣分析結果如Tab 2所示，T0時和T3時3組大鼠pH值、BE和Lac值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與Sham組比較，Shock組和Sevo組在T1和T2時pH值降低，BE值降低，Lac升高(P<0.05)，且兩組間無明顯差異(P>0.05)。

2.3 七氟醚后處理對失血性休克復蘇大鼠海馬線粒體SOD活性的影響SOD活性檢測結果顯示(Fig 1)，與Sham組相比，Shock組海馬線粒體SOD活性明顯降低(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組SOD活性增加(P<0.05)。

Fig 1 Effects of sevoflurane postconditioning on activity of SOD in mitochondria isolated from hippocampus

2.4 七氟醚后處理對海馬MDA含量影響MDA檢測結果顯示(Fig 2)，與Sham組相比，Shock組MDA含量明顯增加(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組MDA含量降低(P<0.05)。

2.5 七氟醚后處理對失血性休克復蘇大鼠海馬SIRT1和PGC-1α蛋白表達的影響Western blot檢測結果顯示(Fig 3)，與Sham組相比，Shock組SIRT1和PGC-1α表達增加(P<0.05)；與Shock組相比，Sevo組SIRT1和PGC-1α表達增加(P<0.05)。

3 討論

七氟醚是近年來臨床常用的吸入麻醉劑，基礎和臨床研究證實，七氟醚預處理和后處理均能發揮腦保護作用。在Dang等[5]的研究中，七氟醚預處理可以影響腦缺血/再灌注后早期小膠質細胞/巨噬細胞的遷移、吞噬和增殖，從而改善腦神經功能。也有實驗表明，七氟醚后處理可以抑制線粒體膜通透性轉換孔的開放，縮短缺血/再灌注大鼠在水迷宮實驗中的逃避潛伏期，下調促凋亡蛋白Bax,上調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，提示七氟醚后處理可以通過減輕線粒體功能障礙，減輕腦缺血/再灌注損傷[6]。

Fig 2 Effects of sevoflurane postconditioning on content of MDA in hippocampus

Fig 3 Effects of sevoflurane postconditioning on expression of SIRT1 and PGC-1α

本實驗采用經右頸總動脈放血30 min，缺血1 h后，在30 min內回輸全部自體血的方法，制備大鼠失血性休克復蘇模型，模擬全身性缺血/再灌注過程。結果表明，與Sham組比較，Shock組和Sevo組放血后MAP明顯降低，pH值和BE降低，Lac升高，提示大鼠失血性休克模型制備成功。回輸自體血后，MAP升高，pH值、BE和Lac與放血前無明顯差異，且大鼠均存活，提示復蘇成功。

Tab 2 Arterial blood gases results

腦缺血/再灌注損傷是一個多因素參與的病理生理過程，包括炎癥反應、細胞內鈣離子超載、興奮性氨基酸毒性作用，以及與ATP生成減少、活性氧(ROS)蓄積、線粒體功能障礙等有關的氧化應激[7-8]。MDA是機體內氧化應激損傷的產物之一,對細胞的代謝和功能均有明顯的影響，其含量的高低也能體現機體受ROS攻擊和損傷的程度[9]。本實驗中，Shock組大鼠海馬組織MDA含量明顯增加，其原因可能是失血性休克復蘇增加了大鼠腦內ROS的產生，蓄積的ROS引發了脂質過氧化反應。而七氟醚后處理減少了MDA的產生，改善了腦組織氧化應激損傷。SOD是機體關鍵的抗氧化超氧歧化物酶類,其水平可以間接反映機體抗氧化應激能力[10]。檢測失血性休克與復蘇大鼠海馬線粒體SOD活性發現，與Sham組相比，其活性明顯降低，而七氟醚后處理可以增加線粒體SOD活性，表明七氟醚后處理可能通過線粒體相關信號途徑，提高機體抗氧化應激能力。

為了進一步探討七氟醚后處理減輕失血性休克復蘇大鼠氧化應激可能的分子機制，本實驗采用Western blot法檢測海馬組織中SIRT1和PGC-1α蛋白的表達。SIRT1是NAD+依賴的組蛋白去乙酰化酶，在抵抗氧化應激、抑制細胞凋亡及神經細胞保護等方面發揮調控作用[11]。PGC-1α是SIRT1的作用底物之一，參與線粒體生物合成及功能維持，是在抗氧應激作用中有重要作用的轉錄因子。研究表明，SIRT1表達增加可以激活PGC-1α的轉錄，從而增加線粒體密度，進而通過誘導抗氧化酶的表達、清除活性氧、抗線粒體損傷等，提高機體抗氧化應激能力[12-13]。本研究發現，與Shock組相比，Sevo組SIRT1和PGC-1α蛋白表達增加，表明七氟醚后處理可以促進SIRT1和PGC-1α蛋白的表達，增強機體抗氧化應激能力。而Shock組的SIRT1和PGC-1α表達量高于Sham組，可能是失血性休克復蘇刺激了內源性SIRT1和PGC-1α的表達，以抵抗缺血/再灌注損傷過程中的氧化應激等損傷。

綜上所述，七氟醚后處理可以通過上調SIRT1、PGC-1α蛋白的表達，減輕失血性休克復蘇大鼠海馬的氧化應激反應。有研究證實[14]，PGC-1α可與下游的核呼吸因子1結合，再激活線粒體轉錄因子A，產生更多的生物學效應。本課題組也將深入研究SIRT1/PGC-1α及下游分子在七氟醚后處理減輕腦缺血/再灌注損傷中的作用。