一種山桐子高質量DNA提取方法

徐陽，龔榜初*，吳開云，白杰健

(1.中國林業科學研究院 亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2.浙江省林木育種技術研究重點實驗室，浙江 杭州 311400；3.青川縣林業和園林局，四川 廣元 628100)

山桐子(IdesiapolycarpaMaxim)，又稱“油葡萄”[1]，適應性強、耐旱、耐貧瘠[2-5]，單株產果量高，全果含油，油脂品質高[6-7]，兼具多種保健功能[8]，是重要的木本油料物種，被譽為樹上油倉[1]。同時山桐子樹形優美，秋日果實深紅色，圓錐狀下垂，也是優良的園藝觀賞樹種[5,9-10]。山桐子產業目前在我國大有星火燎原之勢，在全國各地正迅猛發展[10]。但山桐子童期長[11]、雌雄異株、雄株多的生物學特點[4]，不利于山桐子產業的快速發展，急需開展山桐子雌雄分化、油脂形成等方面的分子生物學研究，在此基礎上，建立山桐子分子輔助育種體系，以加速山桐子產業發展。從生物體中提取DNA是進行分子生物學研究的基礎，山桐子葉片和其他組織中富含大量的多糖、多酚、類菇烯等多種初生與次生代謝產物[12]，提取高質量的DNA比較困難[13]，屬于一種頑拗植物[14]。受限于此，山桐子相關分子生物學研究進展緩慢，現有試劑盒等提取方法所提山桐子DNA濃度較低。李娜等[15]以山桐子轉錄組為材料，開發了19條簡單重復序列(SSR)標記，為山桐子群體遺傳學提供了較好的基礎。在此基礎上，初步展開的SSR等標記分型條帶清晰度也有待提高。據此，本文在植物DNA常用提取方法CTAB法的基礎上進行改良，以期提供一種山桐子高質量基因組DNA提取方法，為山桐子分子生物學研究提供技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年4月初，分別采集6份山桐子種質資源的嫩葉，每份種質視為1份生物學重復，然后裝于凍存管立即存于液氮中，轉移至-80 ℃冰箱保存。其中70、71、72號材料用于比較不同DNA提取方法的提取效果，70、71、72、73、74、75號共6份材料用于SSR分型與簡化基因組測序。

1.2 方法

1.2.1 山桐子DNA提取

采用SDS法[16]、CTAB法[17]、試劑盒法(參照北京天根生化科技有限公司的植物基因組提取試劑盒)、改良CTAB法提取山桐子總DNA。

其中改良CTAB法具體方法：

首先，將嫩葉放入研缽中，加入液氮充分研磨，取粉末加入2 mL離心管中，加至1/2或2/5處為佳，加入PEG漂洗液，翻轉混勻，離心收集沉淀，重復洗滌3次。PEG漂洗液[18-19]：5 mmol·L-1EDTA (pH=8.0)、50 mmol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)、350 mmol·L-1山梨醇、10% PEG 8000、1% β-巰基乙醇(用前加入)。然后，向經PEG漂洗液漂洗的材料中加入1 mL裂解液，65 ℃裂解45 min后離心取上清。CTAB裂解液：1.4 mol·L-1NaCl (pH值8.0)，0.1 mol·L-1Tris-HCl (pH值8.0)，20 mmol·L-1Na·EDTA，2% CTAB，2%PVP。再加入同體積的氯仿∶異戊醇(體積比24∶1)混合液，翻轉混勻，靜置5 min，10 000g離心10 min，將上清轉入新的2 mL離心管中；重復該步驟2～3次，直至分離相中間層無雜質(雜質較少)，上清液清澈。再次將上清液轉入新的2 mL離心管中，加等體積的預冷異丙醇與0.1倍體積的3 mol·L-1醋酸鈉(pH值5.2)，翻轉，置于-20 ℃放置2 h，10 000g離心20 min，棄上清液，加1 mL 70%乙醇清洗DNA沉淀，轉入1.5 mL離心管，10 000g離心5 min，倒掉上清，通風干燥約40 min，保證DNA充分干燥。最后加100 mL ddH2O溶解DNA，完全溶解后，進行檢測或-20 ℃保存。

1.2.2 DNA檢測與相關分子生物學試驗

利用Nanodrop微量分光光度計檢測各方法所提DNA的質量和濃度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測改良CTAB法的DNA完整度。

SSR引物選用李娜等[15]的8號SSR引物(F：TCTCCATCGTACTATTTGAATCTCAT，R：ATCAAT CAAATCAATCACAAGCC))。PCR擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，37 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，5個循環；94 ℃ 1 min，Tm 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環；最后72 ℃ 8 min。利用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠在垂直板電泳儀(美國Bio-Rad)進行SSR分型條帶的電泳分離，250 V電壓下電泳50～60 min，電泳后用AgNO3銀染10 min，用生物電泳圖像分析系統(美國Bio-Rad)進行觀察、拍照。

利用內切酶組合RsaⅠ+HaeⅢ對山桐子基因組DNA進行酶切，酶切文庫質檢合格后用IlluminaHiSeqTM 進行PE125 bp測序[20]。

2 結果與分析

2.1 各方法所提DNA濃度與質量

山桐子葉片中含有較多的雜質，提取DNA較為困難。利用SDS法進行山桐子葉片DNA提取，3個樣本均能提取到一定量的DNA(32.1～80.6 ng·μL-1)，平均為57.73 ng·μL-1，濃度變異幅度較大，為42.21%(表1)；D260/D280為1.35～1.65，均小于1.8，所提DNA中含有較高蛋白質污染；D260/D230為1.01～1.20，均小于2，所提DNA中存在嚴重的糖類與鹽污染。綜合表明，利用SDS方法提取的3個樣本DNA質量均較低，其中72號樣本濃度僅為32.1 ng·μL-1，D260/D280為1.35，D260/D230為1.20，嚴重不合格，無法用于后續的分子生物學研究。

表1 不同DNA提取方法所得山桐子DNA質量比較

利用試劑盒法提取的山桐子DNA，相對于SDS法，純度有較大提升，D260/D280為1.77～1.81，所提DNA中少量蛋白質污染，D260/D230為1.46～1.79，糖類與鹽污染得到一定的控制。CTAB法提取的山桐子DNA濃度顯著高于試劑盒法和SDS法，平均濃度達144.33 ng·μL-1，其中70號樣本DNA濃度可達223.2 ng·μL-1。但CTAB法所提DNA樣本間濃度變異幅度較大，達49.84%，不利于后續分子生物學對樣本濃度的標準化要求；D260/D280比值與試劑盒法相當，為1.62～1.83，DNA樣本中可能存在蛋白質與酚類物質污染，D260/D230低于試劑盒法，高于SDS法，表明所提DNA中也存在較高的糖類與鹽污染。

利用改良的CTAB法提取的3個山桐子樣本DNA濃度可高達417.5～470.5 ng·μL-1，平均為438.93 ng·μL-1，為試劑盒法的8.5倍。D260/D280為1.94～1.97，均高于1.8，D260/D230為2.10～2.17，均高于2，表明各樣本DNA濃度高、純度高，蛋白質、糖類與鹽污染得到極好的控制。電泳結果(圖1)顯示，改良CTAB法提取的DNA條帶稍有拖尾，整齊明亮，說明DNA得率較高且完整。同時樣本濃度與純度各指標變異幅度最少，能夠滿足分子生物學對樣本標準化的要求。

M，DNA maker；70、71、72分別為70、71、72號樣本DNA。圖1 改良CTAB法所提山桐子DNA電泳圖譜

2.2 利用改良CTAB法提山桐子DNA的SSR標記結果

SSR標記具有共顯性、高度重復性等優點，在分子群體遺傳進化、輔助育種等方面應用廣泛。本文利用改良的CTAB法提取6個山桐子樣本DNA，采用李娜等[15]的8號引物進行SSR標記分型。圖2顯示，6個樣本的SSR標記條帶均比較清晰，表明改良的CTAB法所提取的DNA可以滿足SSR標記相關分子試驗所需。

M，DNA maker；左側為maker各條帶大小；70～75分別為70、71、72、73、74、75號山桐子樣本。圖2 利用改良CTAB法所提6個山桐子樣本的SSR標記聚丙烯凝膠電泳結果

擴增片段長度多態性(AFLP)技術、簡化基因組測序等技術可提供較高通量的標記數，在群體分析中具有較高的效率，但此類研究往往依賴于酶切效果，而基因組DNA樣品純度較低等因素可能影響限制性內切酶的活性，導致部分酶切位點未被酶切開，因此對DNA要求較高。酶切效率是評價簡化基因組實驗是否成功的一個關鍵指標。本文采用RsaⅠ+HaeⅢ組合對改良CTAB法所提的山桐子DNA進行酶切，進行酶切文庫的質量評估，并利用IlluminaHiSeqTM 進行PE125 bp測序。本試驗的酶切效率為90.32%，表明酶切效率正常。同時，測序reads插入片段長度主要為364～444 bp(圖3)，表明所提DNA可以滿足基因組測序等試驗要求。

圖3 Reads插入片段分布

3 小結與討論

常用的提取植物核酸的方法如SDS法、CTAB法等只適用于部分植物，用于山桐子DNA提取存在較大局限性。SDS法操作簡單、溫和，如本文數據顯示，通過該方法可提取到一定量的山桐子DNA，但所得到的產物質量與純度不高，糖類、蛋白質、鹽類雜質較多。通過CTAB法，可提取純度較高的山桐子DNA，且對蛋白質污染有較好的控制，DNA純度有所提高。但酚類污染仍較嚴重，且山桐子樣本DNA濃度與純度變異幅度較大，試驗中多次抽提試驗周期較長。隨著提取技術的發展，基于高效核酸吸附柱的核酸提取試劑盒出現，大大提高了核酸提取效率[15]。但本文數據顯示，盡管試劑盒法提取的山桐子DNA純度得以提升，但提升幅度較小，各山桐子樣本DNA濃度仍較低。

Kobayashi等[19]研究發現，PEG洗脫液可有效洗脫植物代謝產物，在鵝掌楸高質量DNA提取中應用效果較好。在此基礎上，本文以CTAB法為基礎，裂解前進行PEG洗脫，并優化與簡化后續CTAB法操作步驟，形成適宜山桐子高質量DNA提取的改良CTAB法。通過本文方法提取的山桐子DNA，DNA濃度可高達417.5～470.5 ng·μL-1，平均為438.93 ng·μL-1，為試劑盒法的8.5倍，所提各樣本DNA蛋白質、糖類與鹽污染得到極好的控制，DNA得率較高且完整，同時各樣本濃度與純度各指標變異幅度最少，可以滿足分子生物學對樣本DNA質量標準化的要求。采用本文改良CTAB法提取的山桐子DNA，可以滿足SSR標記分型、簡化基因組測序等相關分子試驗所需，為山桐子分子生物學的開展提供了基礎。