精氨酸脫亞胺酶對黃酒釀造中氨基甲酸乙酯形成的影響

李加友，陳濤

(1.嘉興學院 生物與化學工程學院，浙江 嘉興 314001；2.宿遷市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所，江蘇 宿遷 223800)

氨基甲酸乙酯(EC)被世界衛(wèi)生組織認定為2 A級致癌物，聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織建議成年人每天的EC總攝入量不超過15 ng·kg-1(以體重計)。黃酒中的EC是發(fā)酵過程中酵母及其他微生物代謝產(chǎn)生的。尿素、精氨酸、氰化物等都可以代謝形成EC的前體物質，如氨甲酰磷酸、瓜氨酸等[1-2]。精氨酸是黃酒中EC形成的主要原因之一。精氨酸可以經(jīng)脫亞胺途徑產(chǎn)生瓜氨酸和氨甲酰磷酸，從而導致氨基甲酸乙酯的形成[3]；因此，研究黃酒生產(chǎn)過程中精氨酸脫亞胺酶的變化情況，掌握形成EC的前體物變化規(guī)律，對建立控制黃酒產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯含量的新工藝具有重要參考價值。為此，特開展試驗研究，并總結報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

糯米，市售；麥曲，購自江蘇微康生物科技有限公司；酒曲和黃酒酵母，購自湖北安琪酵母股份有限公司；檸檬酸(分析純)、L-精氨酸(分析純)、L-瓜氨酸(分析純)，均購自上海生工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃酒釀造

取500 g糯米浸泡48 h，蒸飯前瀝干，蒸汽穿透25 min。用攤飯法冷卻米飯溫度至28 ℃，將其加入發(fā)酵缸中，然后加入25 g麥曲、5 g黃酒酵母(加入前按照使用說明進行活化)、1 L溫開水(40 ℃)，攪拌，使發(fā)酵劑和米飯均勻分布。將發(fā)酵缸置于25 ℃培養(yǎng)箱，5 d后將培養(yǎng)溫度調整為18 ℃，并用檸檬酸調節(jié)體系的pH至3.5。發(fā)酵過程中每隔2 d定期取樣檢測醪液中的精氨酸和瓜氨酸含量。以上工藝均按照無菌操作要求，嚴格控制環(huán)境中雜菌進入發(fā)酵體系，保持發(fā)酵體系的生物穩(wěn)定性。

1.2.2 精氨酸脫亞胺酶粗酶液制備

取酒樣上清液5 mL，在低溫下進行超聲細胞破碎(功率400 W、破碎時間15 min、間歇時間15 min)，10 000 r·min-1離心15 min，棄沉淀，將上清液定容到5 mL即得待測粗酶液。

1.2.3 精氨酸脫亞胺酶酶活測定

取500 μL 100 g·L-1的L-精氨酸溶液和400 μL 20 mmol·L-1pH 5.5的磷酸鹽緩沖液于試管中，加入100 μL粗酶液，充分混勻，45 ℃水浴下反應10 min，迅速煮沸10 min終止反應，10 000 r·min-1離心10 min，測定上清液瓜氨酸含量。

酶活定義：以1 min產(chǎn)生1 μmol的L-瓜氨酸所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.2.4 精氨酸、瓜氨酸和鳥氨酸含量測定

酒樣醪液經(jīng)10 000 r·min-1離心10 min后，準確移取0.5 mL上清液、0.5 mL 0.5 mol·L-1的NaHCO3溶液0.2 mL和25 mL·L-12,4二硝基氟苯(DNFB)衍生化試劑于10 mL試管中，混合后置于60 ℃水浴中避光恒溫加熱60 min，避光冷卻至室溫后用pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液定容至5 mL，靜置15 min，過0.22 μm膜后進樣分析。

采用戴安U-3000高效液相色譜儀進行檢測，其中色譜柱為Acclaim120，C18，5 μm Analytical(4.6 mm×250 mm)，紫外檢測波長360 nm，進樣量20 μL，柱溫30 ℃，流動相B為超純水，流動相C為乙腈溶液，流動相D為乙酸鈉，流速0.8 mL·min-1，時間26 min。梯度洗脫程序如下：0 min，流動相B、C、D的體積分數(shù)分別為15%、15%、70%；13 min，流動相B、C、D的體積分數(shù)分別為31%、31%、38%；21 min，流動相B、C、D的體積分數(shù)分別為34%、34%、32%；23 min，流動相B、C、D的體積分數(shù)分別為50%、50%、0；26 min，流動相B、C、D的體積分數(shù)分別為15%、15%、70%。

2 結果與分析

2.1 黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶的形成動力學

如表1所示，黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶的活性隨著時間推進而有所不同：直到釀造的第4天，才檢測到精氨酸脫亞胺酶活性，此后其活性逐步增加，第10天時其活性達到72 U·mL-1，之后一直到第24天酶活變化不大，基本維持在72～76 U·mL-1，隨后精氨酸脫亞胺酶活性再次逐步增加，第44天時達到146 U·mL-1，此后又維持在相對穩(wěn)定的范圍內。

黃酒釀造過程中的精氨酸脫亞胺酶的活性變化可以分為2個階段：4～12 d為第1階段，24～44 d為第2階段。分別對這2個階段的精氨酸脫亞胺酶活性做動力學分析，得到2個擬合模型(y為酶活，x為時間)：

第1階段的擬合模型為y=1.5x4-20.667x3+98.5x2-177.33x+144(R2=1.000)；

第2階段的擬合模型為y=-0.049 8x4+1.265 9x3-9.898 9x2+30.604x+51.758(R2=0.994 6)。

R2均大于0.99，說明回歸擬合效果好。

表1 黃酒釀造過程中精氨酸、瓜氨酸含量和精氨酸脫亞胺酶活性的變化

注：-表示沒有檢到。

對醪液中精氨酸脫亞胺酶催化產(chǎn)物瓜氨酸的檢測結果發(fā)現(xiàn)，在釀造的前14 d均未能檢測到瓜氨酸，此后瓜氨酸的含量逐步增加，到24 d后瓜氨酸的含量相對穩(wěn)定，自38 d開始稍有下降，但相對穩(wěn)定。醪液中的精氨酸含量從釀造開始就逐步增加，至34 d時達到較高水平，此后精氨酸的含量保持相對穩(wěn)定。

通過對黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶活性及其酶解產(chǎn)物含量的定量分析，發(fā)現(xiàn)了精氨酸脫亞胺酶的階段性變化特征，并且酶活呈上升趨勢；但是，在精氨酸含量逐步增加的情況下，瓜氨酸的含量在24 d后卻沒有明顯增加。這可能是因為瓜氨酸持續(xù)轉化成了鳥氨酸。精氨酸脫亞胺酶和鳥氨酸氨甲酰轉移酶是同簇基因，它們的轉錄是同步進行的。

2.2 醪液中精氨酸脫亞胺酶的催化特性

2.2.1 溫度對精氨酸脫亞胺酶活性的影響

溫度是影響酶催化的重要因子，考查精氨酸脫亞胺酶在不同溫度條件下的酶活，確定其受溫度影響的程度。結果(圖1)表明，隨著反應溫度提高，精氨酸脫亞胺酶催化產(chǎn)瓜氨酸的酶活先顯著增高后下降，在60 ℃時酶活最高。

圖1 溫度對精氨酸脫亞胺酶活性的影響

2.2.2 pH值對精氨酸脫亞胺酶活性的影響

比較不同pH值的緩沖體系對精氨酸脫亞胺酶催化活性的影響，結果如圖2所示。當pH值為6～7時，酶活較大。黃酒釀造中醪液的pH值通常在3～4，精氨酸脫亞胺酶在pH值為4時的酶活是pH值為3時的2倍，由此可知，精氨酸脫亞胺酶活性受醪液pH值影響顯著，控制醪液pH值會對醪液中精氨酸的代謝產(chǎn)生重要影響。

圖2 pH值對精氨酸脫亞胺酶活性的影響

2.3 精氨酸代謝對黃酒中氨基甲酸乙酯形成的影響

根據(jù)對黃酒中精氨酸脫亞胺酶的初步研究結果，比較不同釀造條件下產(chǎn)品中的EC含量，確定精氨酸代謝對EC形成的影響。結果(表2)表明，當起始pH值為3時，醪液中的精氨酸脫亞胺酶活性受到明顯抑制，分別為對照組(pH值為3.5)和起始pH值為4時的23%和22%，且產(chǎn)品中的EC含量也只有對照組和起始pH值為4時的35%和32%，說明控制釀造過程的pH值對精氨酸脫亞胺酶活性和EC形成均有顯著作用。

表2 起始pH值對氨基甲酸乙酯形成的影響

3 小結與討論

氨基甲酸乙酯的大部分前體物質來源于發(fā)酵過程的微生物代謝，通過代謝過程控制或者菌種選育減少前體物質的形成，可以減少產(chǎn)品中的氨基甲酸乙酯[4]。利用精氨酸代謝酶抑制劑控制瓜氨酸等前體物質的形成[5]；精氨酸酶缺陷型或表達受阻的酵母突變菌株不能轉化精氨酸形成尿素[6-8]；將脲基酰胺酶基因整合到酵母菌中，提高脲基酰胺酶的表達能力，可以降低尿素含量[9]；精氨酸轉化能力受阻的酒類酒球菌不能轉化精氨酸為瓜氨酸和氨甲酰磷酸[10]，利用以上方法或菌株生產(chǎn)的葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量顯著下降。酒中氨基甲酸乙酯的形成機理不同，控制方法各異。

通過對黃酒釀造過程中精氨酸脫亞胺酶活性動力學及其底物、產(chǎn)物的過程分析，初步掌握了黃酒中精氨酸的代謝過程。根據(jù)精氨酸脫亞胺酶的酶學性質，建立了一個控制精氨酸酶解產(chǎn)瓜氨酸和氨甲酰磷酸的工藝措施，降低了醪液中氨基甲酸乙酯前體物濃度，產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯含量得到有效控制。結果表明，降低黃酒起始pH值對于控制產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的形成是一個切實可行的工藝措施。