益腎補氣強身茶對免疫抑制小鼠的免疫調節作用及機制研究

羅倫才 羅丹 童妍

615000涼山彝族自治州第二人民醫院1，四川 西昌

610031西南交通大學生命科學與工程學院2，四川 成都

益腎補氣強身茶屬新型中藥復方制劑，具有安養五臟、潤燥通便、降脂通脈功能。研究證實[1-3]，益腎補氣強身茶中黃精多糖、黃芪總黃酮能有效逆轉或修復環磷酰胺(CTX)所致免疫抑制模型小鼠的免疫功能。天然中草藥具有一定的調節免疫功能，且毒副作用少。本文主要探討益腎補氣強身茶對于免疫抑制小鼠是否有免疫調節作用。

資料與方法

試驗藥物：益腎補氣強身茶；CTX。

動物：KM 小鼠，雌雄各半，60只，體重18～22 g，合格證號：SCXK(川)2013-24。

試劑：考馬斯亮蘭(A045-2)、酸性磷酸酶(ACP)測試盒(A060-1)、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(A020-1)；1640 培養基(SH30809.01)、胰酶(J150031)；二甲基亞砜(D-5879)、 LPS(L2880)、 刀 豆 蛋 白A(ConA)(C2272)、中性紅溶液(N6264)。

儀器：722可見分光光度計；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器。

方法：小鼠隨機分為6 組，空白組、模型組、陽性組及益腎補氣強身茶高、中、低劑量組，每組10 只。除空白組外，其余組給藥隔天進行皮下注射CTX 30 mg/kg 建立免疫功能低下小鼠模型；陽性組左旋咪唑25 mg/kg，益腎補氣強身茶高、中、低劑量組(5.08 g/kg、2.54 g/kg、1.27 g/kg)，空白組和模型組給予等體積蒸餾水，連續灌胃10 d。

觀察指標：①胸腺、脾臟指數測定，分別取胸腺、脾臟稱量濕重。②LDH 和ACP 活性測定，按試劑盒說明進行測定。③按常規方法制備小鼠脾細胞懸液，然后使用四甲基偶氮唑鹽法測定ConA 誘導的小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖反應[4]。使用MTT法對自然殺傷細胞(NK細胞)和淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK 細胞)活性進行測定。④按常規方法制備腹腔巨噬細胞，檢測巨噬細胞吞噬中性紅能力。

統計學方法：采用SPSS 16.0 軟件分析數據。計量資料用(±s)表示，采用t檢驗；計數資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

對免疫抑制小鼠免疫器官、ACP 和LDH 活性的影響：胸腺、脾臟指數測定顯示，各組胸腺、脾臟指數比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1和表2。

ACP 活性測定：與空白組比較，模型組小鼠脾臟樣本中ACP 活性降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組比較，陽性藥組、中劑量組ACP 活性升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

LDH統計結果：與空白組比較，模型組小鼠脾臟樣本中LDH活性降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，陽性藥組、中劑量組LDH 活性升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

對免疫抑制小鼠免疫細胞的影響：ConA 誘導的小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖反應：與空白組比較，模型組的ConA誘導的T淋巴細胞增殖減少，差異有統計學意義(P＜0.01)；與模型組相比，陽性組、高/中劑量組T淋巴細胞增殖數量增多，差異有統計學意義(P＜0.01)，見表5。

表1 各試驗組胸腺指數(±s)

表1 各試驗組胸腺指數(±s)

組別 n 胸腺指數空白組 10 0.004 2±0.001 3模型組 10 0.002 5±0.000 4陽性藥組 10 0.002 3±0.000 5低劑量組 10 0.002 1±0.000 4中劑量組 10 0.001 8±0.000 6高劑量組 10 0.002 9±0.000 8

表2 各試驗組脾臟指數(±s)

表2 各試驗組脾臟指數(±s)

組別 送檢標本(n) OD空白組 4 0.003 0±0.000 3模型組 4 0.003 0±0.000 6陽性組 5 0.002 7±0.000 6低劑量組 5 0.002 3±0.000 4中劑量組 3 0.002 0±0.000 3高劑量組 6 0.002 7±0.000 5

NK 細胞、LAK 細胞活性測定結果，見表6。

巨噬細胞吞噬中性紅能力：與空白組比較，模型組OD 值降低，差異有統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，陽性組OD 值增加，差異有統計學意義(P＜0.01)；與模型組比較，高、中劑量組OD 值增加，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表7。

討 論

機體處于免疫抑制狀態時，機體的非特異性免疫功能下降，可表現為淋巴細胞增殖和分化能力下降。淋巴細胞分為許多功能特異的群體，比如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞等，本次實驗即對這些細胞進行檢測。其中檢測T 淋巴細胞、B 淋巴細胞的增殖能力可以在一定程度上反映細胞免疫功能。不同于T 淋巴細胞和B 淋巴細胞，NK 細胞屬于直接殺傷靶細胞效應的淋巴細胞。當機體的非特異性免疫功能下降時，也表現為NK 細胞活性降低。本實驗采用MTT法檢測NK 細胞和LAK 細胞的殺傷活性，作為判斷機體免疫功能強弱的依據。在NK細胞活性測定中，與模型組相比，陽性組及益腎補氣強身茶高、中、低劑量組的NK細胞活性有所升高。LAK細胞是體外誘導的非特異性殺傷細胞，許多研究表明，LAK 細胞的前體細胞就是NK 細胞。本研究中ConA 誘導的小鼠脾臟T 淋巴細胞增殖反應中，與模型組相比，陽性組及益腎補氣強身茶高、中劑量組的脾臟細胞增多，結果顯示補腎養身茶可以促進脾臟T 淋巴細胞的增殖，增強機體的非特異性免疫功能。與模型組相比，陽性組益腎補氣強身茶高、中、低劑量組的LAK 細胞數值均有所升高，表明益腎補氣強身茶對免疫抑制小鼠有一定增強免疫功能的作用。

表3 ACP活性測定(±s)

表3 ACP活性測定(±s)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

組別 樣本數量(n) 活力(U/gprot)空白組 8 101 7.85±82.34模型組 11 898.66±94.51#陽性組 9 102 4.62±94.98?高劑量組 13 947.24±116.82中劑量組 6 104 4.03±163.25?低劑量組 9 894.39±144.49

表4 藥物對肝組織中LDH活力的影響(±s)

表4 藥物對肝組織中LDH活力的影響(±s)

注：與空白組比較，#P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05。

組別 樣本數量(n) 活力(U/g prot)空白組 8 457 99.12±793 1.06模型組 7 310 77.26±896 6.49#陽性組 6 413 04.32±774 4.87?高劑量組 7 377 30.21±925 5.49中劑量組 6 408 39.31±111 83.70?低劑量組 6 383 30.89±910 9.67

表5 ConA、LPS誘導的小鼠脾臟細胞增殖的影響(±s)

表5 ConA、LPS誘導的小鼠脾臟細胞增殖的影響(±s)

注：與空白組比較，△△P＜0.05；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

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表6 NK細胞、LAK細胞活性(%)

表7 對巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

表7 對巨噬細胞吞噬功能的影響(±s)

組別 n OD空白組 6 0.79±0.01模型組 6 0.72±0.02△△陽性組 6 0.77±0.01??高劑量組 6 0.76±0.02?中劑量組 6 0.75±0.02?低劑量組 6 0.72±0.03

巨噬細胞是一種重要的免疫細胞，活化的巨噬細胞免疫能力更強，而巨噬細胞活化的一個重要標志是產生一氧化氮，實驗分析了腹腔巨噬細胞的吞噬活性，在吞噬細胞吞噬能力測定中，與模型對照組相比，陽性組及高、中劑量組OD 值增加，間接說明了與模型組相比，這三個劑量組提高了免疫抑制小鼠巨噬細胞的吞噬能力。ACP 作為溶酶體酶，參與巨噬細胞吞噬外來病原體的過程，所以ACP 的活性高低在一定程度上反映了吞噬細胞的活化程度。本實驗數據顯示，益腎補氣強身茶中劑量組能提高免疫抑制小鼠的ACP 活力。LDH 是糖降解的必須酶，而吞噬細胞的吞噬過程則需要糖降解提供的能量，所以LDH 的活性與巨噬細胞激活的程度相關，是巨噬細胞激活的標志之一。在本次實驗中，LDH 活性測定結果顯示，與模型組相比，陽性組、中劑量組LDH 活力升高。本研究證實，益腎補氣強身茶各劑量組對免疫抑制大鼠表現出不同程度的增強免疫能力的作用，這為益腎補氣強身茶的進一步應用提供了理論依據。