間充質干細胞對大鼠急性肺損傷模型的干預研究

方閱 劉振威

(1.上海市第一人民醫院臨床藥學科，上海 200080;2.上海市第一人民醫院呼吸與危重癥科，上海 200080)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由心源性以外的各種直接或間接因素所引起的以急性彌漫性肺泡炎性病變為特征的肺部急性炎癥反應，是臨床上常見的危重性疾病，可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。ALI發病機制復雜，發病率高，且尚無有效的治療措施，其死亡率高達40%以上。因此，尋找新的有效治療方法，是基礎研究和臨床研究中都急待解決的難題。血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是一種與 ACE 相似的酶，是腎素—血管緊張素系統(rennin-a giotensin system，RAS)的重要組成部分[1]。研究發現，ACE2在ALI/ARDS、SARS中發揮著保護作用[2-3]。在酸吸入、內毒素以及膿毒血癥誘導的ARDS模型中，ACE2基因敲除小鼠與表達ACE2的對照組小鼠相比表現出更嚴重的ALI癥狀及病理表現[4]。通過應用催化活性的重組ACE2蛋白可以改善野生型及ACE2基因敲除小鼠的ALI癥狀及病理表現，提示ACE2可作為ALI/ARDS可能的新治療藥物[5]。近年來的研究發現，植入動物體內的間充質干細胞(mesenchymal stemcells，MSCs)能夠在ALI模型動物中參與抑制炎癥反應，觸發與修復相關的生長因子，不同程度地減輕肺的炎性反應，給ALI/ARDS的治療帶來了新方向[6-9]。目前，MSCs主要來源于骨髓，但該途徑來源相對貧乏，獲取過程為有創操作，取材過程困難，大大制約了MSCs的臨床應用。人臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUMSCs)是MSCs的一種，其可從廢棄的胎盤中分離提取，來源廣泛，較骨髓來源的MSCs具有更低的免疫原性，更易體外擴增，且無倫理學制約，逐漸成為組織工程和再生醫學中最具發展前景的種子細胞。本研究基于HUMSCs的特性和ACE2對肺損傷的保護作用，采用轉染法構建攜帶ACE2基因的HUMSCs，旨在通過觀察其對博來雷素(BLM)誘導的ALI大鼠肺組織病理改變，檢測肺組織炎癥水平變化等指標，評價攜帶ACE2基因的HUMSCs 移植對ALI的保護作用及機制，為未來臨床提高干細胞移植及攜帶基因聯合治療ALI奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠120只，體質量(250±20) g，由中國科學院動物中心提供。

1.1.2試劑 BLM (美國Sigma公司)；DMEM/F12培養基、胎牛血清(美國Gibco公司)；PE anti-mouse CD45、CD 105， FITC anti-mouse CD29、 CD34、CD44(美國eBiocsience)；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ACE2抗體(美國Cell Signal 公司)；MPO檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，INF-γ 、IL-4引物(上海生工生物工程公司)；TNF-α ELISA試劑盒(美國R&D公司)。

1.1.3主要儀器 流式細胞儀(FACSCalibur，美國BD Bioscences公司)；PCR儀、電泳儀和電源(美國Bio-rad公司)。

1.2實驗方法

1.2.1HUMSCs的分離培養 無菌條件下取正常足月剖宮產健康嬰兒臍帶，剪成約1 mm2的組織塊，將其接種于細胞培養板，加入含有雙抗及10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱內培養，待細胞生長至約80%融合時，用含胰蛋白酶的消化液消化，按104/cm2的密度傳代至細胞培養瓶中進行培養。

1.2.2細胞表面標志鑒定 取對數生長期第4代的細胞，分別加入PE anti-mouse CD86、 CD45、CD 105， FITC anti-mouse CD29、CD34、CD44標記HUMSCs。用流式細胞儀檢測HUMSCs表型。

1.2.3ACE2基因轉染人臍帶間充質干細胞 利用Trizol試劑從人肺組織提取總RNA，然后經逆轉錄獲得人ACE2的cDNA片段。構建慢病毒轉移載體，然后與包裝載體共轉染293T細胞，擴增病毒。其次還轉染一個GFP基因在臍帶間質干細胞內作為追蹤臍帶間質干細胞的基因。收集病毒后轉染HUMSCs，在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP熒光陽性率來檢測轉染效率。公式：發出轉染率=綠色熒光的細胞數/可見光下總細胞數×100%，并測定轉染了ACE2基因HUMSCs的表型。

1.2.4BLM誘導建立大鼠ALI模型 實驗采用健康成年雄性SD大鼠120只，隨機分為5組，每組24只：(1)BLM組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈注入生理鹽水)；(2)ACE2組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈注入由慢病毒攜帶ACE2基因)；(3)HUMSCs組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈單純注入HUMSCs而沒有ACE2基因)；(4)HUMSCs-ACE2組(BLM肺損傷的動物模型，靜脈輸注攜帶ACE2基因的干細胞)；(5)NS對照組(正常動物模型)。BLM組、ACE2組、HUMSCs組、HUMSCs-ACE2組采用一次性氣管內滴注BLM(5 mg/kg)制造肺損傷的動物模型，NS對照組滴注生理鹽水。收集肺損傷前(D0)、肺損傷后第3天(D3)、第7天(D 7)和第14天(D 14)標本行相關指標檢測。

1.2.5生存分析 每組12只動物用于單獨記錄生存狀況，記錄每只動物的生存天數，觀察14 d的研究周期內的生存狀況，計算生存率并繪制生存曲線。

1.2.6收集肺泡灌洗液測定中性粒細胞和總蛋白 利用10%水合氯醛麻醉大鼠，取預冷的生理鹽水灌洗支氣管肺泡，收集肺泡灌洗液(BALF)，離心后取上清液根據BCA試劑盒說明測定總蛋白含量，取沉淀部分經1 mL PBS重懸，常規瑞氏染色后，在顯微鏡下人工計數中性粒細胞的數量。

1.2.7肺組織形態學觀察及肺損傷嚴重度病理評分 制備肺組織石蠟切片，脫蠟，蘇木素染色，伊紅染色，光鏡下觀察病變區及附近肺組織病理變化。重點就肺充血及肺出血情況、肺泡內滲出、肺泡及血管壁的中性粒細胞浸潤、肺泡壁的增厚程度以及肺透明膜的形成等四種情況進行評估及對肺損傷嚴重度打分。共分為五個等級：0=沒有損傷，1=輕微損傷，2=中度損傷，3=重度損傷，4=極重度損傷。最終將各個評分進行匯總，總分即代表肺損傷程度。

1.2.8Western-blotting測定肺組織ACE2蛋白表達 取肺組織勻漿，離心，取上清，進行蛋白定量和免疫印記。各實驗組取等量蛋白20μg進行電泳分析。采用12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白條帶通過濕法轉至PVDF膜上，室溫下封閉，然后與抗ACE2抗體孵育過夜，洗脫一抗，加二抗(1∶1 000)孵育，洗去二抗，經過化學發光法顯色后顯影、定影。

1.2.10肺水含量程度測定 新鮮肺組織取下后稱濕重，然后置烤箱烤至恒重，稱干重，計算兩次肺組織重量之比，即肺組織的濕干比(W/D)，以反映肺水腫的程度。

1.2.11RT-PCR測定肺組織中促炎因子INF-γ和抗炎因子IL-4 mRNA 變化 取肺組織勻漿，加入TRIzol試劑冰上提取總RNA，然后根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。IL-4基因引物序列如下：正向引物 5’-CTG ACG GCA CAG AGC TAT TGA-3’，反向引物 5’-TAT GCG AAG CAC CTT GGA AGC-3’；INF-γ基因引物序列如下：正向引物 5’-GCA TCT TGG CTT TGC AGC T-3’，反向引物 5’-CCT TTT TCG CCT TGC TGT TG-3’；β-actin基因引物序列如下：正向引物 5’-AGC TGC GTT TTA CAC CCT TT-3’，反向引物 5’-AAG CCA TGC CAA TGT TGT CT-3’。采用2-△△Ct方法來分析數據。其中，△Ct=Ct(目的基因)—Ct(內參基因)，△△Ct=△Ct(樣品)—△Ct(對照)。

1.2.12ELISA測定肺組織中細胞因子TNF-α的含量 取肺組織用生理鹽水冰上勻漿，離心后取上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測TNF-α的含量。

1.3統計學方法 各項實驗重復三次，使用SPSS13.0 One-way ANOVA 中的Bonferroni Test 進行多個樣本間的兩兩比較，P<0.05示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1HUMSCs的形態 無菌條件下從正常足月剖宮產健康嬰兒臍帶中分離的HUMSCs在CO2培養箱內常規培養1～2 d后，顯微鏡下部分梭形貼壁細胞，7 d后形成形態相對一致的、呈集落狀態生長的長梭形細胞，14 d后形成80%融合的單層貼壁細胞層。

2.2ACE2基因經過慢病毒轉染HUMSCs的轉染率 采用倒置顯微鏡觀察GFP熒光情況以檢測轉染效率。結果顯示，HUMSCs轉染病毒后24 h開始檢測到熒光，熒光強度隨時間不斷增強，于第5天達到高峰。實驗中按染指數MOI=5、10、20、40、80分別接種相應體積的的病毒液于細胞，當MOI=10時，GFP熒光檢測陽性細胞百分比>95%，且細胞感染后可以看出細胞未出現病變，細胞活力及生長狀態良好。MOI≥10時，細胞死亡率明顯增加，到MOI=80時，細胞大量死亡，故確定轉染的最佳MOI值=10。

2.3轉染前后HUMSCs表型檢測結果 用流式細胞儀對轉染前后HUMSCs 進行表面標志檢測。結果顯示轉染前CD29、CD44、CD105均呈陽性表達，而 CD34、CD45 、CD86呈陰性表達，提示所獲得的細胞符合HUMSCs特性。HUMSCs經轉染ACE2基因后其表型并未發生顯著變化，提示轉染本身以及ACE2并未影響HUMSCs相關表型的變化。

2.4生存分析 通過繪制Kaplan-Meier生存分析曲線圖，表明模型動物在實驗后3～7 d區間內容易死亡，而此區間外死亡率較低。采用Log Rank(Mantel-cox)比較各干預組與BLM組的生存率差異，結果顯示HUMSCs-ACE2組差異顯著。見圖1、表1。

圖1 生存分析曲線

組別BLM組ACE2組HUMSCs組HUMSCs-ACE2組NS對照組BLM組-0.1670.0870.037?0.000??

注：與BLM組對比，*P<0.05；與BLM組對比，**P<0.01。

2.5BALF中中性粒細胞數目變化 中性粒細胞是反映肺血管通透性的指標之一，在正常情況下BALF中數量很少。經BLM刺激后的各實驗組BALF中中性粒細胞數量增加，與NS對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，中性粒細胞數量在第3、7、14天較同期的BLM組呈現時間依賴性下降趨勢，其中以HUMSCs-ACE2組降低量明顯(P<0.05)。見圖2。

注：與同時期NS對照組對比，#P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，*P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，**P<0.01。

圖2BALF中中性粒細胞計數

2.6BALF中總蛋白含量變化 BALF中總蛋白量是反映肺血管滲透性的重要指標，血管滲透性增加，血漿中蛋白滲出量增加，提示炎癥損傷發生。通過BCA試劑盒檢測BALF中總蛋白量的實驗結果表明，經BLM刺激后，各實驗組中BALF的總蛋白量升高，其中以第3天的BALF的總蛋白量表達最高；HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，BALF的總蛋白量降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同期的BLM對照組呈現時間依賴性下降趨勢(P<0.05)。見圖3。

注：與同時期BLM組對比，#P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，*P<0.05；與D3 HUMSCs-ACE2組對比，**P<0.01。

圖3BALF中總蛋白含量變化

2.7肺組織形態學觀察及肺損傷嚴重度病理評分 經HE染色結果可知，肺組織損傷在第3天到第7天最為嚴重，肺部出現水腫，并有較多炎性細胞浸潤，肺纖維化嚴重，與動物死亡數的時間分布相符，隨后損傷有減輕趨勢，肺泡炎癥好轉，少量淋巴細胞浸潤，成纖維細胞少量增生。其中，第7天的HE染色結果如下：NS對照組肺組織結構正常，肺泡結構完整光滑，無炎性細胞浸潤(圖4 A)；BLM組肺組織水腫，少量出血，光鏡下觀察可見大量中性細胞浸潤，肺泡間隔增厚，肺泡壁破壞(圖4 B)；HUMSCs-ACE2組炎性細胞浸潤明顯減少，肺損傷程度較模型組顯著減輕(圖4 E)。肺損傷嚴重度病理評分結果顯示，各實驗組肺組織損傷情況，以第3天最嚴重。經過ACE2、HUMSCs、HUMSCs-ACE2干預后，肺組織損傷情況得到不同程度改善，尤其以HUMSCs-ACE2組表現為佳。ACE2組、HUMSCs組、HUMSCs-ACE2組與BLM實驗組比較，僅HUMSCs-ACE2組的病理評分在3、7、14 d差異有統計學意義。見表2。

注：A：NS對照組；B：BLM組； C：ACE2組； D：HUMSCs組； E：HUMSCs-ACE2組。

圖4D7肺組織病理HE染色(×200)

表2 病程中肺組織損傷嚴重度總體評分分]

注：與同時期BLM實驗組對比，*P<0.05。

2.8Western-blotting測定肺組織ACE2蛋白表達 提取肺組織總蛋白后通過Western-blotting檢測ACE2蛋白表達情況。結果顯示NS對照組的ACE2蛋白在各時間點表達差異無統計學意義。與NS對照組比較，BLM組ACE2蛋白表達下降最顯著；ACE2組、HUMSCs組及HUMSCs-ACE2組的ACE2蛋白呈下降趨勢，但在第3天開始回升，HUMSCs-ACE2組的總蛋白中ACE2表達增量最明顯，在第14天達到高峰，與同時期的BLM組相比差異有統計學意義。見圖5。

2.9肺組織MPO活力測定 肺組織MPO活力是反映肺組織中中性粒細胞浸潤程度的指標之一，可以間接反映肺組織炎癥反應程度和肺損傷程度。如圖6所示，經BLM刺激后，各實驗組中MPO活力顯著升高，在第3天達到高峰，隨后在第7天、第14天開始回落。與NS對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，MPO活性降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時期的BLM組呈現時間依賴性下降趨勢，差異具有統計學意義(P<0.05)。其中，在第3天， HUMSCs-ACE2組的MPO活性低于HUMSCs組，但差異無統計學意義；在第7、14天，HUMSCs-ACE2組的MPO活性較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低。

2.10肺水含量程度測定 肺干濕比在BLM造模后較NS對照組顯著上升，HUMSCs-ACE2組在第3天到達高峰后開始下降，ACE2組、HUMSCs組則在第7天達到高峰。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，肺干濕比均有所降低，以HUMSCs-ACE2組降低最明顯。見圖7。

2.11RT-PCR測定肺組織中促炎因子INF-γ和抗炎因子IL-4的mRNA 變化 圖8為肺組織中INF-γ的mRNA表達情況。BLM組和HUMSCs組INF-γmRNA表達量一直維持在較高水平，在第7天達到高峰，隨后隨時間推移開始下降，ACE2組及HUMSCs-ACE2組INF-γmRNA表達量在第3天達到高峰，隨后在第7、14天開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比INF-γmRNA水平降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時期的BLM組呈現時間依賴性下降趨勢(P<0.05)。圖9為肺組織中IL-4的mRNA表達情況。各實驗組中IL-4的mRNA表達顯著下降，在第3天達到最低量，隨后在第7天、第14天開始上升。與NS對照組相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，IL-4的mRNA表達升高，以HUMSCs-ACE2組升高量最明顯，第3、7、14天較同時期的BLM組呈現時間依賴性上升趨勢(P<0.05)。

2.12ELISA測定肺組織中細胞因子TNF-α的含量 結果如圖10所示，BLM組中TNF-α含量一直維持在較高水平，在第3天達到高峰，在第7、14天隨著時間推移開始下降。HUMSCs組、ACE2組及HUMSCs-ACE2組與同時期的BLM組相比，TNF-α的表達降低，以HUMSCs-ACE2組降低量明顯，第3、7、14天較同時期的BLM組呈現時間依賴性下降趨勢(P<0.05)。其中，在第3天， HUMSCs-ACE2組TNF-α的表達高于HUMSCs組，但在第7、14天，HUMSCs-ACE2組TNF-α的表達較ACE2組、HUMSCs組均明顯降低，并呈現時間依賴性。

3 討 論

ALI是臨床常見的危急重癥，炎癥爆發反應是其重要的病理特征之一。本研究采用一次性氣管內滴注BLM制造肺損傷動物模型，模擬ALI的病理生理過程，通過肺組織病理學及相關炎癥指標的檢測顯示，肺組織中出現炎性滲出、水腫，肺血管膜受損和通透性增加，符合ALI的模型要求。鑒于ALI/ARDS目前尚無有效治療措施，死亡率很高，而臟器移植又存在許多局限，因而干細胞移植，通過誘導轉化為受損肺細胞來實現肺臟的修復和再生，將是一個嶄新的治療策略。

干細胞是當前生命科學研究的熱點之一，可作為體內基因治療的載體，被廣泛應用于多種疾病的治療[10-12]。 近來已將MSCs引入到肺損傷的治療中，在適當的條件下MSCs可定向分化為包括肺組織細胞和毛細血管內皮細胞等組織細胞[13]。當前，MSCs的主要來源仍然是骨髓，但存在來源有限、取樣時要進行侵襲性操作等缺點，因而尋找一種新的更具優勢的替代細胞成為當務之急。HUMSCs可從廢棄的胎盤中分離提取，來源豐富且不涉及倫理學爭議[14]。ACE2基因對AngⅡ有極高的催化效率，具有擴張血管、參與炎癥反應調控的作用[15-17]。研究表明，ACE2基因缺失能加劇BLM誘導的肺損傷，而重組ACE2對于小鼠ALI有保護作用[18]。目前尚無攜帶ACE2基因的HUMSCs對ALI的作用研究，故本實驗旨在進一步研究其在肺損傷中的作用機制以及為肺損傷的臨床治療提供理論依據。

基于HUMSCs和ACE2分別對肺損傷的保護作用的研究，本實驗通過BLM構建大鼠ALI模型，旨在修復受損肺細胞、改善肺組織病理學、減輕肺損傷指標及促炎性細胞因子等方面觀察以HUMSCs為媒介的ACE2基因轉染對大鼠ALI的治療作用。本研究采用具有轉化修復與融合修復肺損傷功能的HUMSCs作為運輸工具，通過Lentivirus病毒載體轉染ACE2基因，并形成穩定表達，輸入大鼠體內進行基因治療，同時設置GFP作為示蹤蛋白，追蹤HUMSCs在體內的變化，結果顯示HUMSCs攜帶ACE2/eGFP基因，經靜脈輸入體內后，在肺組織受損處多處出現表達GFP的肺泡上皮細胞，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs在肺部有轉化修復的能力。

本研究結果顯示，經BLM誘導ALI后，模型組大鼠的ACE2顯著下降到較低水平，單獨給予ACE2基因的模型組和單獨給予HUMSCs的模型組大鼠在第3天開始回升，而給予攜帶ACE2基因的HUMSCs大鼠肺組織中的ACE2表達在第3天也逐漸增加，且增加程度較前兩組高，在第14天達到高峰，說明攜帶ACE2基因的HUMSCs，較單獨ACE2或HUMSCs具有更好的修復效果。

本研究就肺水腫、肺組織病理學改變、肺組織中MPO活性的高低以及肺組織中促炎性細胞因子INF-γ、TNF-α和抗炎因子IL-4水平的變化，對干預前后實驗動物的肺損傷嚴重程度進行了探討。通過病理學研究和肺組織損傷嚴重度總體評分發現，肺組織損傷在第3天和第7天最為嚴重，與動物死亡數時間分布相符，隨后損傷有減輕趨勢。經ACE2、HUMSCs和攜帶ACE2基因的HUMSCs這三種不同方法干預后，肺組織病理學和肺組織損傷得到不同程度的改善，尤其以HUMSCs-ACE2組表現為佳，提示攜帶ACE2的HUMSCs在改善實驗大鼠整個病程的肺損傷上存在優勢。

中性粒細胞在肺損傷發病機制中是反映肺水腫程度的關鍵因子，MPO是中性粒細胞的嗜天青顆粒所釋放的過氧化物酶，其水平與中性粒細胞數目表達量呈正比，兩者過量生成均可造成組織損傷。通過對肺組織MPO活性和BALF中中性粒細胞數目的檢測，結果顯示第3天各組的MPO活性和BALF中中性粒細胞數目達到高峰，其中HUMSCs-ACE2組動物的MPO活性和BALF中中性粒細胞數目與HUMSCs和ACE2組比較，在第3天后開始迅速下降，表現出改善跡象，提示攜帶ACE2基因的HUMSCs對于治療肺損傷較HUMSCs或ACE2單獨治療有優勢。

細胞因子的改變是肺損傷病程中的一個重要體現。細胞因子按炎癥反應可分為促炎因子和抗炎因子，其中促炎因子INF-γ、TNF-α、IL-1、TL-6等，抗炎因子主要有IL-4、TL-10等。本研究選取促炎因子INF-γ、TNF-α及抗炎因子主要有IL-4作為研究對象，通過ELISA和RT-PCR檢測其表達水平。結果表明，經BLM刺激后，各組促炎因子INF-γ、TNF-α表達量增加，在第3天達到高峰，抗炎因子IL-4的表達量下降，在第3天達到最低值，隨后的第7、14天促炎因子INF-γ、TNF-α表達量隨時間降低，抗炎因子IL-4的mRNA水平隨時間呈上升趨勢，均以HUMSCs-ACE2組表達量改變最明顯，提示HUMSCs協同ACE2基因治療對于抑制促炎因子INF-γ、TNF-α表達、提高抗炎因子IL-4的表達較單純ACE2、HUMSCs治療效果更佳。

實驗結果顯示，攜帶ACE2基因的HUMSCs能有效降低ALI大鼠肺部炎癥滲出和血管通透性程度，降低肺組織中促炎因子基因水平，并能提高抗炎因子IL-4以及ACE2的表達，從而減輕ALI大鼠病理損傷程度，提示HUMSCs介導的ACE2治療具有修復肺損傷的功能，且治療效果優于單純HUMSCs或ACE2的治療效果。

目前HUMSCs移植治療ALI/ARDS的研究多停留在動物模型階段，應用到臨床治療仍面臨許多挑戰，但隨著HUMSCs對肺組織修復機制的深入研究和進一步闡明，我們相信結合ACE2基因治療的HUMSCs移植將在ALI/ARDS 的臨床應用中呈現光明的前景。

(圖5～10見封三)