魚卵和仔稚魚鑒定技術研究進展

金雨婷 蔣日進 趙進 劉志堅 管峰

摘要 魚卵和仔稚魚是魚類繁殖的早期幼體形態，其分布、數量和種類對于漁業資源的可持續發展和生物學研究具有重要意義，魚卵和仔稚魚鑒定是這一研究的重要環節。魚卵和仔稚魚的鑒定先后歷經了形態學鑒定和分子鑒定兩個技術發展階段。簡述魚卵和仔稚魚鑒定在漁業資源普查和科學研究中的重要意義以及2種主要鑒定技術的研究進展，為魚卵和仔稚魚鑒定研究提供基礎知識。

關鍵詞 魚卵和仔稚魚;物種鑒定;形態學;分子鑒定;DNA條形碼

中圖分類號 S917文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0018-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.005

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract Fish eggs and larvae are early juvenile forms of fish reproduction， and their distribution， quantity and species are of great significance for the sustainable development of fishery resources and biological research. And the key part of this study field is species identification of fish eggs and larvae. There had two stages of technological development had been gone in the species identification of fish eggs and larvae， i e morphological identification and molecular identification. In this review， the importance， significance， utilization and progress of fish eggs and larvae species identification in the fishery census and scientific research were focused， the aim is to provide some guidance for fish eggs and larvae study.

Key words Fish eggs and larvae;Species identification;Morphology;Molecular identification;DNA barcoding

基金項目 浙江省科技計劃項目（2017C32081，2017F50015）。

作者簡介 金雨婷（1996—），女，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向：動物生物技術。*通信作者，副教授，博士，從事動物生物技術研究。

收稿日期 2019-03-11

海洋魚類是人類生活甚至生存所需的重要自然資源，歷史記載在2 000多年前人們就開始捕撈并不斷開發近海的漁業資源，其為人們直接提供了諸多高營養價值的食品和經濟產品。海洋漁業資源中不僅具有可開發利用價值較高的動物，如海洋魚類、頭足類、甲殼類、貝類等，還有大型藻類和植物資源等，這些資源的利用效率和配置效率直接影響著海洋經濟和生態的發展。另一方面，海洋環境污染和資源的過度開發導致海洋漁業資源減少的案例不勝枚舉。例如，浙江舟山漁場的大黃魚、小黃魚、帶魚和烏賊即著名的舟山“四大海產”，近年來捕撈量呈現逐年減少的趨勢[1-3]，甚至大黃魚幾乎絕跡。另一方面，開展人工培育和飼養以保持漁業資源的可持續發展，人工飼養的大黃魚在我國漁業市場已經占據了一定市場份額[4-5]。而在海洋漁業的循環和生態平衡中，浮游生物是海洋生態系統中的重要組成部分，魚卵和仔稚魚又是浮游生物的重要組分，既是能量的消費者又是被捕食者，對維持生態平衡具有重要意義[6]。魚類資源的調查鑒定是漁業資源監測、生態學和生物多樣性研究、魚類產地溯源保護和漁業資源開發利用以及海洋保護區建設的重要前提，而魚卵和仔稚魚的鑒定是魚類資源調查鑒定的重要基礎。

筆者綜述了魚卵和仔稚魚鑒定在漁業資源研究中的作用和地位，同時對形態學鑒定和快速發展的DNA條形碼鑒定技術做了系統闡述，旨在為魚卵和仔稚魚鑒定研究工作者以及初學者提供理論基礎。

1 魚卵和仔稚魚鑒定在漁業資源研究中的地位和作用

魚卵和仔稚魚是魚類繁殖季節產生后代的一種重要方式，魚類生殖方式多種多樣，多數卵生為主，也有卵胎生和假胎生的種類。魚類繁殖除了具有嚴格的季節性規律，還有固定的繁殖海域，與水域溫度、水質營養、鹽度和浮游生物豐富度等多種指標相關。因此，魚卵和仔稚魚的種類、分布區域和數量是海洋環境監測和漁業資源調查以及科學研究的重要指標。魚卵和仔魚是漁業可持續發展的根本，其早期成活率決定了漁業資源的世代強弱，其數量直接決定了成魚資源的補充量。我國近年來陸續開展了江河流域和近海區域的魚卵和仔稚魚調查，為了解掌握我國漁業資源和生物多樣性提供了大量數據資料。例如，鄭惠東[7]對福建東山灣海域不同季節的魚卵和仔稚魚數量和分布進行了調查，明確了這一海域的魚類分布和生態類型，也對這一海域的生態環境有了更多了解。滸苔藻團是魚類產卵的重要場所，陳月華等[8]研究了東海區域在滸苔藻團中魚卵的數量和種類，可以通過保護滸苔藻團為魚類提供繁殖場所，這一研究為資源恢復和生態環境的平衡維持提供了思路。我國三峽大壩的建設改變了局部水資源的分配，建成后的調查表明，磨刀溪是魚類資源最為豐富的支流，鯉魚和鯽魚是主要魚種[9]，為三峽庫區的漁業資源保護和三峽大壩對漁業資源的影響提供了重要參考。由此可見，魚卵和仔稚魚鑒定在資源調查、生態學研究和生態環境可持續發展研究中都具有重要的社會價值和生態意義，也是當今社會發展和國家海洋戰略的重要部分。

2 魚卵和仔稚魚鑒定技術研究概況

魚卵和仔稚魚的鑒定技術歷經了形態學鑒定和分子鑒定兩個主要發展過程，現階段主要以兩者結合為主，但兩種鑒定技術在方法上各有優缺點，在實際應用中兩者可以相互驗證，互為補充，使得鑒定準確性提高，效率也大大增加。

2.1 形態學鑒定技術及應用

魚卵和仔稚魚的形態學鑒定是早期人們對于魚類鑒定的基本手段，主要以形態觀察比較為主，依據魚卵和仔稚魚的形態、大小、卵膜、卵黃、卵周隙、脂肪球、油球、內膜、絨毛膜、卵黃間隙和色素及分布等特征對魚卵進行鑒定[10-13]，也可通過觀察孵化過程的形態變化進行鑒定[14]，形態學鑒定和顯微鏡等成像技術的發展密不可分，且隨著現代成像技術的發展準確性也有了更進一步的提高。但同時形態學鑒定技術也受到鑒定人員的經驗和儀器設備的制約。另一方面，魚卵和仔稚魚早期發育階段時間短，形態變化復雜，近緣物種間形態差異不明顯，有記載可查的資料不超過300種，因此形態學鑒定的局限性限制了其在諸多未知魚類鑒定中的應用[15]。盡管受到人員經驗和儀器的制約，但在分子鑒定技術普遍應用之前，形態學鑒定在魚類的早期鑒定中一直是一項常規且普遍應用的技術，現如今形態學鑒定和分子鑒定技術互補，二者成為魚卵和仔稚魚現代鑒定方法的主要手段[11，16]。資料報道，截至2006年已記載描述的大西洋魚類就達2 235種，但是推測僅有9%的魚類記載了可以用于鑒定的早期形態特征[17]，不足總量的10%[18];同樣，印度洋-太平洋地區的仔稚魚形態研究記錄也不足50%，在很大程度上限制了形態學技術在魚卵和仔稚魚鑒定中的應用。同時，隨著海洋漁業從業人員的經驗減少和人才更替，加上形態學鑒定儀器設備的更新換代成本較高，也制約了形態學鑒定技術的推廣普及[16]，盡管如此，形態學鑒定技術在很多魚類資源鑒定中仍發揮了重要作用。房恩軍[19]和周永東[20]等對渤海和舟山海域魚卵和仔稚魚的調研顯示，我國這兩個漁業主產區的魚類資源逐漸減少。對福建東山灣海域春夏魚卵和仔稚魚鑒定，明確了這一海域34種魚類的分類關系、生態類型以及魚卵的數量與海水鹽度負相關關系，為海洋資源的合理開發利用提供了參考依據[7]，在舌鰨類亞種短吻紅舌鰨分類方面進行的形態學和分子鑒定的對比驗證，為分子鑒定提供了形態學證據[21]。但另一方面，由于魚類發育過程短，形態變化復雜，不同種間形態差異不明顯，仔稚魚生長期變化快且受到環境等因素的影響，加上魚卵采集后的保存方法也會對形態學鑒定產生一定影響，這些因素在很大程度上制約了形態學鑒定技術在魚卵和仔稚魚鑒定中的應用[13]。在一項對魚卵和仔稚魚五個實驗室開展的獨立鑒定對比實驗中，形態學鑒定到種的準確率只有13.5%，況且現代形態學鑒定需要借助電鏡掃描、X光等技術設備因而也受到儀器制約[22-23]。因此，當今形態學鑒定在應用中往往與分子鑒定相結合，互為補充。陳永久等[24]在對浙江舟山海域的魚卵鑒定中以形態學鑒定作為分子鑒定的初步鑒定手段，即形態學鑒定到屬，再用分子鑒定到種。Hofmann[11]等則用形態學鑒定為參照，對鱈魚、鯖魚和竹莢魚3種常見經濟魚類DNA條形碼鑒定技術進行評測。隨著分子鑒定的發展，形態學鑒定逐步成為與分子鑒定的輔助和驗證手段，尤其在對于一些未知物種的鑒定識別中更是不可或缺的識別手段。黃鎮宇等[25]采用形態學測量和DNA條形碼技術結合的鑒定技術對我國鯔科魚類進行了分類研究，凸顯了兩種鑒定方法結合的重要性和必要性。總之，形態學鑒定是魚卵和仔稚魚鑒定發展過程中的重要技術發展階段，并伴隨著分子鑒定技術的發展在不斷革新，并與現代分子鑒定技術互為補充，在實際應用中具有不可替代的作用。

2.2 分子鑒定技術及應用

隨著分子生物學的發展和多物種基因組數據庫不斷豐富以及測序技術的發展，從常見的牛羊等家養動物的物種鑒定發展到依據基因數據庫可以對大量稀有甚至未知物種的鑒定，分子鑒定技術獲得了快速發展，如今已有魚類鑒定的專有數據庫[26]。物種鑒定的多種分子鑒定技術中，以DNA條形碼技術為代表，具有相對簡單且易于掌握操作的優點[10-11，27]，基因靶標以線粒體COI基因為代表，還有基于12S rRNA、16S rRNA和CytB基因鑒定的方法[28-30]，這些技術基本相似，其大致過程如圖1所示，即收集待測樣品后提取DNA，PCR擴增目的基因序列，經測序后對序列作對比分析即可鑒定物種。

DNA條形碼技術始于2003年，2006年首次報道用于魚卵和仔稚魚的鑒定[31]，隨著該技術的發展現已用于多種動物的物種鑒定，在魚卵鑒定中已經有了大量的實踐應用[10，23，32-35]，且顯示出比傳統形態學鑒定的優勢[23-24]，尤其在近緣物種鑒別、隱種發現和自動化檢測方面更具有優勢。阮瑞等[9]采用DNA條形碼技術分析確定了三峽大壩消落區733粒魚卵和108尾仔稚魚的種類，陳月華等[8]也利用這一技術確定了東海滸苔藻團中所產卵魚的種類，劉守海等[15]鑒定了長江入海口的仔稚魚種類，把近緣物種且形態上難以鑒定的矛尾蝦虎魚、斑尾刺蝦虎魚以及蝦虎魚科的5個亞種進行了分類，提高了仔稚魚鑒定的精確度。張楠等[36]利用DNA條形碼技術鑒定廣東省江門沿岸海域魚卵為鱸形目和鯡形目并闡明了環境變化對產卵魚類的影響，為這一海域的魚類保護和環境保護提供了證據。李淵等[37]在浙江省蒼南海域的仔稚魚中鑒定出一個形態學未能鑒定的物種，顯示出該技術在物種鑒定中的優勢。尤卡坦半島海域的魚卵和仔稚魚形態學非常相似，Leyva-Cruz等[10]在該海域的300顆魚卵獲得139條序列，歸類分析屬42個類群35屬33個種，其中無齒鯧是第一次在該海域發現的新物種。Kawakami等[38]用16S rRNA基因對馬里亞納群島西海域魚卵的分子鑒定中發現了3個新種，證明這一海域以加曼氏底鱈、密斑刺鲀和大鱗鱗孔鯛為優勢魚種并具有分布差異，為這一海域的魚類保護和資源開發利用提供了重要證據材料。由此可見，DNA條形碼技術比形態學鑒定在發現新物種、易于掌握和適用的廣泛性方面的優勢，但也有其不足的一面，如必須依賴基因數據庫，若基因庫中沒有收錄的物種則只能鑒定到近緣物種甚至會出現錯誤。

在鑒定技術方法上，由于魚卵組織少，傳統方法提取DNA的過程容易造成DNA丟失，而用于DNA條形碼COI基因的引物也有多組，不同引物與樣品DNA的特異性也直接影響到PCR擴增效率和測序成功率。對魚卵的鑒定大多使用了Ward等[39]和Folmer[40-41]等報道的魚類鑒定的引物，包括特異性引物和簡并引物[10，13，15，23，36]，由于這些引物在某些物種的特異性不強也會影響鑒定成功率（部分60%左右）。基于COI通用引物改造而來的加尾引物采用2對上下游引物組合和M13載體的通用測序引物，彌補了原有COI基因引物擴增量的不足[42-44]，還簡化了對引物需要多次組合優化的繁瑣過程，大大提高了鑒定成功率[45]，成為魚類物種鑒定優先選擇的引物組合[11，28，35，46-47]。DNA條形碼鑒定技術也在不斷改進，已有可以用于鑒定多個未知物種的宏條形碼技術，這些不斷發展的分子鑒定技術在實用中和形態學鑒定互為補充，使得魚類和仔稚魚鑒定變得越來越更為簡單便捷。

圖1 DNA條形碼鑒定魚卵和仔稚魚基本過程

Fig.1 The basal process of species identification for fish eggs and larvae using DNA barcoding

3 小結與展望

魚卵和仔稚魚是海洋漁業資源循環發展的儲備和資源補充，其種類鑒定有著重要的生態學研究價值和社會經濟意義。魚卵和仔稚魚的鑒定歷經了形態學鑒定的發展階段，但受到魚卵發育過程短、形態變化大和數據資料少以及鑒定所需人力物力大，耗時長等因素的制約而未能在魚類研究中得到普遍應用。而近年來發展起來的DNA鑒定技術尤其DNA條形碼技術顯現了諸多的優勢，在魚卵鑒定中不受其形態和發育階段的影響，加上其諸多優勢已經在鑒定中廣泛應用。這一技術在發展中與形態學鑒定互為補充，隨著測序技術發展、物種數據庫的完善和數字PCR以及前處理技術的發展，相信在漁業資源的鑒定中會發揮越來越大的作用。

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