不同品系小麥分蘗期TaSPL17基因表達分析

沈文俊 趙吉強

摘要[目的]探究9個品系小麥分蘗相關基因TaSPL17基因表達與單株分蘗力強弱的關系。[方法]通過實時熒光定量PCR技術，從基因表達水平角度，分析9個品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與不同品系小麥分蘗力強弱的關系。[結果]不同品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因表達存在顯著差異，單株分蘗力較強的多穗型品系煙農19、瑞豐1號、Bonito-32，TaSPL17基因表達處于相對較低水平;分蘗力中等的中大穗型品系濟麥22、石優17、衡06-6632、濟寧936098，TaSPL17基因表達處于相對中等水平;分蘗數較少的大穗型品系蘭考906、泰山021，TaSPL17基因表達處于相對較高水平，TaSPL17基因對小麥單株分蘗力具有調控作用。[結論]為研究小麥分蘗力強弱能力提供了基因表達水平上的理論依據，為選育理想株型提供了理論基礎。

關鍵詞 小麥;分蘗;TaSPL17;理想株型

中圖分類號 S188文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0101-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract[Objective]To explore the relationship between the expression of TaSPL17 gene related to wheat tillering in 9 wheat lines and the tiller ability of individual plants.[Method]From the perspective of gene expression， the relationship between the relative expression of TaSPL17 gene in the stem of 9 wheat lines at the tillering stage and the tillering ability of different lines wheat lines were analyzed by the quantitative realtime PCR.[Result]There were significant differences in the expression of TaSPL17 gene in the stem of different wheat lines at tillering stage. TaSPL17 gene expression level was relatively low in multispike lines with strong tillering ability， such as Yannong 19， Ruifeng 1 and Bonito32; the TaSPL17 gene expression was at a relatively moderate level in mediumlarge spike lines with medium tillering ability， such as Jimai 22， Shiyou 17， Heng 06-6632 and Jining 936098;TaSPL17 gene expression was relatively high in large spike lines with few tillering ability， such as Lankao 906 and Taishan 021， TaSPL17 gene had regulation effect on tillering ability of wheat.[Conclusion]The results provide a theoretical basis for the gene expression of tiller ability and the breeding of ideotype.

Key words Wheat;Tiller;TaSPL17;Ideotype

作者簡介 沈文俊（1993—），女，山東濰坊人，碩士研究生，研究方向：植物分子發育生物學。*通信作者，副教授，博士，從事植物分子發育生物學研究。

收稿日期 2019-05-06

小麥（Triticum aestivum L.）作為世界上最重要的糧食作物之一，為全球超過1/3的人口提供主要食糧。提升糧食產量是育種工作者的主要目標，同時挖掘糧食產量潛力也是我國小麥品種改良的長期任務。隨著分子生物學的發展，挖掘和利用提升產量的基因資源，將會為高產、高抗小麥新品種的培育提供科學的資源保障。小麥在完成植物生活史的過程中會經歷種子萌發、營養生長、生殖生長和衰老凋亡等一系列的發育階段，每個階段都表現出獨有的形態學和生理學上的特征。從拔節期到孕穗期，小麥經歷了從營養生長到生殖生長的轉變。莖尖分生組織由產生新葉轉變為產生幼穗。從穗的形成、花的發育再到開花，各個發育階段都會影響籽粒的最終產量[1]。

小麥從營養生長到生殖生長的各個階段都會有新的植物器官形成，這些器官發育程度、形成時期、過渡時機都會對小麥的最終產量造成較大的影響。例如，花從營養生長到開花的正確時機對于確保結實成功至關重要，一個小的開花時間延遲會導致生物量和產量增加，過早開花則會導致生物量和種子量減少[2]。植物株型同樣是決定產量的主要因素之一。株型包括植株的高度，莖稈的粗壯程度，分蘗力的強弱，葉片的寬度、厚度以及夾角等。農作物產量與農作物單株形態建成有著必然的聯系，植物理想株型應具備莖稈粗壯抗倒伏，分蘗數、葉片寬厚及夾角合理，耐受生物脅迫和非生物脅迫的能力等要素。隨著農作物分子育種的快速發展，育種工作者有望在小麥中實現理想株型的概念。

SPL（SQUAMOSA-promoter binding proteinlike）基因是編碼植物蛋白的一類轉錄因子，在基因結合位點處富含GTAC序列，該序列是SBP結構域的核心基序，具高度保守性，SBP-box轉錄因子在調控植物營養生長和生殖生長階段轉變、花器官和果實發育、光信號轉導及植株形態建成等諸多發育階段中起到至關重要的作用[3]。迄今為止僅在高等綠色植物中發現此類家族基因，最初從金魚草花序cDNA文庫中篩選得到，因其具有SQUAMOSA啟動子結合活性且能夠結合花器官分生組織決定基因而命名。SPL家族基因是調控植物株型的重要基因，近年來在模式植物擬南芥中發現17個SPL家族基因，農作物水稻中發現19個SPL家族基因以及小麥中發現58個SPL家族基因[4-6]。對這些植物SPL家族基因的研究發現，它們大多數都具有miR156/157識別位點，其轉錄翻譯受到miR156/157的調控，參與了植物生長發育的各個階段，包括在植物形態建成與器官發育的整個過程中，例如在植物根系生長、植物葉片發育、植物分蘗形成、植物花器官發育和果實成熟、生物脅迫與非生物脅迫的應答以及植物激素信號轉導等多個方面都發揮了重要的作用[7]。

在農作物形態建成方面，分蘗是水稻、小麥等主要禾本科植物的重要農學性狀，小麥產量的構成因素包括單位面積上小麥穗數、穗粒數以及千粒重3個重要因素，分蘗力的強弱又與農作物成穗率直接相關，從而間接地影響農作物單位面積的產量[1]。分蘗不僅受到植物激素的調控，而且受到分蘗相關基因的調控。在水稻理想株型研究中，SPL家族基因在其形態建成中的作用至關重要，例如OsSPL8在葉耳的發育方面起作用;OsSPL14具有減少分蘗、增加產量的作用;OsSPL16具有減少分蘗，控制籽粒大小、形狀的作用等。后續研究發現，將水稻OsSPL14基因過量表達會使植株分蘗數降低、莖稈粗壯抗倒伏，增加植株產量[8-10]。通過進一步研究發現IPA1基因可以直接綁定到水稻控分蘗基因OsTB1的啟動子上，激活OsTB1的表達，抑制水稻分蘗芽的生長，減少植株分蘗數[11]。結合水稻研究成果，在小麥中克隆得到OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17，研究發現TaSPL17基因在小麥穗部和莖基部表達量較高[12-13]，表明TaSPL17基因可能與小麥的分蘗有關，并且可能會使小麥增產[14]。筆者通過對9個品系小麥分蘗期莖基部組織材料分蘗相關基因TaSPL17基因相對表達量進行分析，結合不同品系小麥單株分蘗力強弱，探究不同品系小麥分蘗相關基因TaSPL17基因表達與單株分蘗力強弱的關系，為選育理想株型提供分子生物學理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選用單株分蘗力較強的多穗型品系煙農19、瑞豐1號、Bonito-32，分蘗力中等的中大穗型品系濟麥22、石優17、衡06-6632、濟寧936098，以及分蘗數較少的大穗型品系蘭考906、泰山021。高純度種子由煙臺市農業科學研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取。在小麥分蘗期分別取得9個品系小麥莖基部組織材料，采用艾德萊生物（Aidlab）公司生產的EASY spin植物RNA快速提取試劑盒，按照說明書中步驟提取小麥材料的總RNA，并對提取的RNA進行質量檢測。

1.2.2 反轉錄。取1 μg左右的總RNA，將提取的9種樣品采用兩步法進行反轉錄，獲得cDNA。反轉錄反應體系及程序為：第一步（10.0 μL體系：總RNA 1.0 μg，Oligo dT 1.0 μL，RNase Free ddH2O補齊至10.0 μL;程序：72 ℃，30 min，放置于冰上保存），第二步（20.0 μL體系：第一步產物10.0 μL，5×Buffer 4.0 μL，10 mmol/L dNTP 1.0 μL，RNA Inhibitor 0.2 μL，M-MLV 1.0 μL，RNase Free ddH2O補齊至20.0 μL;程序：42 ℃，90 min;70 ℃，15 min）。反應結束后將cDNA稀釋20倍后于-20 ℃保存，作為熒光定量PCR的模板。

1.2.3 實時熒光定量PCR。通過對實時熒光定量PCR引物進行優化，設計并篩選出TaIPA1基因定量分析引物，使用德國生產的Rotor Gene Q儀器及Vazyme公司生產的ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，檢測TaSPL17基因相對表達量，分析小麥分蘗相關基因TaSPL17的表達結果，結合不同品系小麥分蘗力的強弱，探究兩者之間的關系。

1.3 數據分析

定量結果、熔解曲線分析用Rotor-Gene Q series software完成。利用Excel 2016軟件作圖、作表及誤差處理。

2 結果與分析

2.1 不同品系小麥分蘗期莖基部總RNA提取

將9個品系的小麥分蘗期莖基部組織材料使用RNA快速提取試劑盒提取總RNA。經超微量分光光度計檢測RNA樣品濃度和純度，結果顯示：所有樣品A260/A280的比值均在1.988～2021，A260/A230的比值均在2.038～2.324，濃度值均在1 780～2 760 ng/μL，說明所提取的RNA均濃度高、純度好、無雜質或小分子物質污染。將RNA樣品在1%瓊脂糖凝膠電泳中進行檢測，樣品均呈現出比較清晰的18S和28S這2條主帶（圖1），表明所提取的樣品RNA具有較好的完整性，樣品質量較高，可以用于反轉錄反應。

2.2 不同品系小麥分蘗期TaSPL17基因相對表達量分析

以提取的9個品系小麥分蘗期莖基部總RNA反轉錄成的cDNA為模板，對實時熒光定量PCR引物進行優化，設計并篩選出TaIPA1基因定量分析引物，選擇TaGAPDH和TaeEF作為內標基因（表1），經PCR驗證后得出3對引物共同的最佳退火溫度為60 ℃。使用Vazyme公司生產的含有SYBR Green I染料的熒光定量試劑盒進行實時熒光定量PCR反應，反應程序設定為預變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃30 s，延伸72 ℃30 s進行40個循環。每個樣品都做重復對照，反應結束后對所有樣品的熔解曲線（圖2）進行分析，確保基因特異性擴增，并采用雙內參計算法計算TaSPL17基因相對表達量（圖3）。從熔解曲線可以看出，利用不同內參引物及目標基因引物進行PCR擴增時，擴增產物均為單峰，說明基因實現特異性擴增，且不同引物的熔解溫度之間存在差異。使用雙內參法計算基因相對表達量可進一步對試驗數據進行校正，減小試驗誤差。

從定量分析作圖結果來看，不同品系小麥分蘗期分蘗相關基因TaSPL17基因表達存在明顯差異，所選材料瑞豐1號、煙農19和Bonito-32品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于較低水平;衡06-6632、石優17、濟寧936098、濟麥22品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于中等水平;泰山021、蘭考906品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量處于較高水平。

3 結論與討論

結合水稻方面的研究成果，與水稻OsIPA1/OsSPL14基因直系同源的小麥TaIPA1/TaSPL17基因可能具有相同的生物學功能，即該基因表達上調會使植株分蘗數降低、莖稈粗壯抗倒伏，增加植株產量。由此，根據所選材料定量分析結果可以看出瑞豐1號、煙農19和Bonito-32品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他6個品系相比表達較低，結合這3個品系具有單株分蘗力較強、多穗的特點可以得出TaSPL17基因表達下調會使小麥單株分蘗力增強;衡06-6632、石優17、濟寧936098和濟麥22品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他5個品系相比表達中等，結合這4個品系具有分蘗力中等，穗型中、大的特點可以得出TaSPL17基因表達處于中等水平時，小麥的形態建成有利于提升產量，符合理想株型的概念[15];泰山021、蘭考906品系小麥分蘗期莖基部組織TaSPL17基因相對表達量與其他7個品系相比較高，結合這2個品系具有分蘗數較少、穗大的特點可以得出TaSPL17基因表達上調會使小麥單株分蘗力減弱。結合不同品系小麥分蘗能力及穗型等特點可以得出，與水稻理想株型形態建成相關基因水稻OsIPA1/OsSPL14的直系同源基因TaIPA1/TaSPL17在小麥中具有相同的生物學功能，并且結果表明，小麥TaIPA1/TaSPL17基因在不同品系的小麥分蘗期都具有調控分蘗能力的作用，對于分蘗數多少、穗型大小造成不同的影響。由此得知，小麥TaIPA1/TaSPL17基因在小麥單株形態建成及單株產量方面具有重要作用。

通過對小麥分蘗期莖基部組織材料TaSPL17基因定量表達分析，從基因表達水平角度初步探究9個品系小麥分蘗力強弱與分蘗相關基因TaSPL17基因表達之間的關系，為選育理想株型小麥、提升作物產量提供分子生物學理論基礎。對于小麥TaSPL17基因拓展研究應用以及在農作物分子育種上應用，有望使農作物提升產量，但是農作物產量不僅受植株形態建成的影響，而且受氣候條件、溫度條件、土壤條件、種植模式等因素的影響。

參考文獻

[1]高志剛.探討提高小麥產量的措施[J].科技創業家，2013（2）：201.

[2]ZHANG B，LIU X，ZHAO G Y，et al.Molecular characterization and expression analysis of Triticum aestivum squamosapromoter binding proteinbox genes involved in ear development[J].Journal of integrative plant biology，2014，56（6）：571-581.

[3]王炳南.小麥 SPL 基因的比較分析和功能研究[D].北京：中國農業科學院，2015.

[4]BIRKENBIHL R P，JACH G，SAEDLER H，et al.Functional dissection of the plantspecific SBPdomain：Overlap of the DNAbinding and nuclear localization domains[J].Journal of molecular biology，2005，352（3）：585-596.

[5]YANG Z F，WANG X F，GU S L，et al.Comparative study of SBPbox gene family in Arabidopsis and rice[J].Gene，2008，407（1/2）：1-11.

[6]HULTQUIST J F，DORWEILER J E.Feminized tassels of maize mop1 and ts1 mutants exhibit altered levels of miR156 and specific SBPbox genes[J].Planta，2008，229（1）：99-113.

[7]MIURA K，IKEDA M，MATSUBARA A，et al.OsSPL14 promotes panicle branching and higher grain productivity in rice[J].Nature genetics，2010，42（6）：545-549.

[8]張鐵懷，徐開杰，劉曙東，等.小麥TaSPL17基因的克隆、組織特異性表達及原核表達分析[J].西北農業學報，2015，24（7）：37-43.

[9]高新梅，張金民，崔桂賓，等.小麥TaSPL17基因在苗期對不同激素處理的響應[J].麥類作物學報，2019，39（1）：29-34.

[10]劉霞.小麥產量相關基因TaSPLs的克隆和功能分析[D].太原：山西大學，2014.

[11]高新梅.小麥 SPL 家族基因TaSPL17的功能研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2018.

[12]劉霞，張斌，毛新國，等.小麥 tae-MIR156 前體基因的克隆及其靶基因TaSPL17多態性分析[J].遺傳，2014，36（6）：592-602.

[13]XIE K B，WU C Q，XIONG L Z.Genomic organization，differential expression，and interaction of SQUAMOSA promoterbindinglike transcription factors and microRNA156 in rice[J].Plant physiology，2006，142（1）：280-293.

[14]JIAO Y Q，WANG Y H，XUE D W，et al.Regulation of OsSPL14 by OsmiR156 defines ideal plant architecture in rice[J].Nature genetics，2010，42（6）：541-544.

[15]LU Z F，YU H，XIONG G S，et al.Genomewide binding analysis of the transcription activator ideal plant architecture1 reveals a complex network regulating rice plant architecture[J].The plant cell，2013，25（10）：3743-3759.