何首烏九蒸九曬炮制工藝研究

路麗 張洪坤 林欽賢 黃玉瑤 吳韶輝 潘林燕 高貫彪

摘要[目的]闡明何首烏傳統炮制工藝九蒸九曬過程中多成分含量變化的科學內涵。[方法]采用傳統的黑豆共蒸法進行九蒸九曬，并首次監測炮制過程中多成分的含量變化。[結果]隨著何首烏蒸曬次數的增加，浸出物、二苯乙烯苷含量呈明顯的下降趨勢，游離蒽醌含量則顯著上升;多成分含量測定中，沒食子酸呈現先上升后下降，兒茶素、二苯乙烯苷含量逐漸減少，大黃素、大黃素甲醚呈緩慢上升趨勢，5-羥甲基糠醛含量變化不明顯。[結論]何首烏九蒸九曬過程中性狀及各成分含量變化規律明顯，可為何首烏的炮制提供理論依據和工藝參考。

關鍵詞 何首烏;九蒸九曬;炮制工藝;多成分含量;變化規律

中圖分類號 R282文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）15-0177-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.15.049

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract[Objective]The research aimed to clarify the scientific connotation of the change of multicomponent content in the processing technology of ninetime repeat of the steaming and sundrying （NRSSP） of Polygonum multiflorum.[Methods]To steam with black beans and NRSSP，and for the first time monitoring the change of multicomponent content during processing.[Results]With the increase of steaming times of Polygonum multiflorum，the contents of alcohol soluble extract and stilbene glycoside showed a significant downward trend，the content of free anthraquinones increased significantly;in the determination of multicomponent content，gallic acid first increased and then decreased，the content of catechin and stilbene glucoside decreased gradually，the content of emodin and physcion slowly increased，the change of the content of 5hydroxymethylfurfural was not obvious.[Conclusion]The rules of characteristics and contents of the main components in the processing technology of NRSSP of Polygonum multiflorum are obvious，it can provide a theoretical basis and process reference for the processing.

Key words Polygonum multiflorum;Ninetime repeat of the steaming and sundrying;Processing technology;Multicomponent content;Variation law

基金項目 國家中醫藥管理局中藥標準化項目（ZYBZH-Y-AH-03）。

作者簡介 路麗（1990—），女，安徽滁州人，藥師，碩士，從事中藥研發及質量評價研究。*通信作者，主管藥師，碩士，從事中藥研發及其質量評價研究。

收稿日期 2019-03-11

何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）為蓼科植物何首烏的干燥塊根。經黑豆汁炮制后的何首烏具有補肝腎、益精血、烏須發、強筋骨、化濁降脂等功效，可用于血虛萎黃、眩暈耳鳴、須發早白、腰膝酸軟、肢體麻木、崩漏帶下、高脂血等癥[1]，含有主要成分包括二苯乙烯類、蒽醌類化合物、磷脂類，另含鞣質、五味子素、沒食子酸、兒茶素、游離的必需氨基酸類化合物及豐富的微量元素等[2-3]。

歷史上何首烏的炮制方法較多[4]，不少中醫古籍[5-7]提倡九蒸九曬，因此法太過繁瑣且生產效率很低，能源和人力消耗大，并且一般認為炮制時間太長會使得炮制品質量下降，故如今多數飲片企業已不采用，為了適應時代要求，新工藝、新技術被不斷引入現代炮制研究中[8-10]。為改進何首烏傳統炮制方法，致使其古今炮制方法不盡相同，經典九蒸九曬法并沒有被嚴格地傳承下來，2015版《中國藥典》制何首烏項下并未明確規定炮制次數，為探究九蒸九曬法是否科學合理有必要，其科學內涵急需詮釋。因此，筆者采用HPLC法測定不同蒸曬次數炮制何首烏時各主要藥效成分含量，旨在探明炮制過程中各成分含量變化規律，為客觀詮釋何首烏傳統炮制工藝九蒸九曬的科學內涵提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent-1200型高效液相色譜儀;RHP-100型高速多功能粉碎機（浙江永康市榮浩工貿有限公司）;XS204型電子天平（d=0.1 mg，Mettler Toledo）;HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）;DHG-9245A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試材 甲醇（批號170721，天津市四友精細化學品有限公司，色譜純）;乙腈（批號170511，天津市四友精細化學品有限公司，色譜純）;磷酸（批號161226，天津基準化學試劑廠，分析純）。二苯乙烯苷對照品（2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，批號110844-201512）、大黃素對照品（批號110756-201512/110756-200110）、大黃素甲醚對照品（批號110758-201013）、沒食子酸（批號110831-201204）、5-羥甲基糠醛（批號111626-201610）、兒茶素（批號110877-201604），中國食品藥品檢定研究院。何首烏生藥（產地四川，批號1708244332）、黑豆（產地安徽，批號1708184251），均由亳州市滬譙飲品廠提供;生品何首烏經廣州香雪制藥股份有限公司連林生高級工程師鑒定為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊根。

1.3 方法

1.3.1 炮制方法。取何首烏約3 kg，稱重，取1/10留樣拍照，剩余樣品備用，取270 g黑豆，加水浸泡過夜，第2天取黑豆汁與何首烏樣品混勻，悶潤至黑豆汁吸盡。轉移至蒸籠中，鋪一層何首烏，再鋪一層泡軟的黑豆，層層鋪盡，常壓隔水蒸制6 h，放入55 ℃烘箱中干燥至6成干。留取蒸出液，取240 g黑豆與之混合，浸泡過夜，取1/9留樣，剩余樣品與前一晚浸泡的黑豆汁混勻，悶潤至黑豆汁吸盡。轉移至蒸籠中，鋪一層何首烏，再鋪一層泡軟的黑豆，層層鋪盡，常壓隔水蒸制5 h，放入55 ℃烘箱中干燥至6成干。留取蒸出液，取210 g黑豆與之混合，浸泡過夜。如此進行反復9次的蒸制，每次分別留樣，用于含量測定。炮制品性狀描述見表1。

1.3.2 浸出物含量測定。按照醇溶性浸出物測定法（2015版《中國藥典》四部 通則2201）項下的熱浸法測定，用乙醇作為溶劑，計算供試品中醇溶性浸出物含量。

1.3.3 二苯乙烯苷含量測定。

1.3.3.1 色譜條件與系統適用性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以乙腈-水（25∶75）為流動相;檢測波長為320 nm。

1.3.3.2 對照品溶液的制備。取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL含0.225 7 mg的溶液，即得。

1.3.3.3 供試品溶液的制備。取本品粉末（過四號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，靜置，上清液濾過，取續濾液，即得。

1.3.3.4 線性關系的考察。分別精密吸取對照品溶液2、4、6、8、10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積（X）為橫坐標、進樣量（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.3.3.5 精密度試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.3.1”色譜條件，重復進樣6次，記錄二苯乙烯苷峰面積的RSD。

1.3.3.6 穩定性試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h間隔進樣10 μL，記錄二苯乙烯苷峰面積的RSD。

1.3.3.7 重復性試驗。取經2次蒸曬的制首烏粉，按“1.3.3.3”供試品溶液的制備方法共制備6份供試品溶液，進行含量測定，計算二苯乙烯苷含量的RSD。

1.3.3.8 加樣回收率試驗。精密稱取已知含量的何首烏粉末（過四號篩）0.1 g，平行6份，分別加入等量二苯乙烯苷對照品適量，混勻，按“1.3.3.3”制備二苯乙烯苷供試品溶液的方法處理，進行含量分析，計算加樣回收率。

1.3.3.9 樣品測定。分別稱取何首烏生品及九蒸九曬后的樣品，按“1.3.3.3”方法制備供試品溶液，每個樣品平行3次，進樣測定，以均值作為結果，計算樣品中二苯乙烯苷的含量。

1.3.4 蒽醌類含量測定。

1.3.4.1 色譜條件與系統適用性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-0.1%磷酸溶液（80∶20）為流動相;檢測波長為254 nm。

1.3.4.2 對照品溶液的制備。取大黃素對照品、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含大黃素81.328 8 μg、大黃素甲醚32.802 2 μg的溶液，即得。

1.3.4.3 供試品溶液的制備。取本品粉末（過四號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液5 mL作為供試品溶液A（測游離蔥醌用）。另精密量取續濾液25 mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，精密加8%鹽酸溶液20 mL，超聲處理（功率100 W，頻率40 kHz）5 min，加三氯甲烷20 mL，水浴中加熱回流1 h，取出，立即冷卻，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，洗液并入分液漏斗中，分取三氯甲烷液，酸液再用三氯甲烷振搖提取3次，每次15 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液B（測總蒽醌用）。

1.3.4.4 線性關系的考察。分別精密吸取大黃素、大黃素甲醚對照品溶液2、4、6、8、10 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以峰面積（X）為橫坐標、進樣量（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.3.4.5 精密度試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.4.1”色譜條件，重復進樣6次，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD。

1.3.4.6 穩定性試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h間隔進樣10 μL，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD。

1.3.4.7 重復性試驗。取經2次蒸曬的制首烏粉，按“1.3.4.3”的方法制備供試品溶液，進行含量測定，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚含量的RSD。

47卷15期 路 麗等 何首烏九蒸九曬炮制工藝研究

1.3.4.8 加樣回收率試驗。精密稱取已知含量的何首烏粉末（過四號篩）0.5 g，平行6份，分別加入等量大黃素、大黃素甲醚對照品適量，混勻，按“1.3.4.3”游離蒽醌供試品溶液的方法處理，進行含量分析，計算加樣回收率。

1.3.4.9 樣品測定。分別稱取何首烏生品及九蒸九曬后的樣品，按“1.3.4.3”方法制備供試品溶液，每個樣品平行3次，進樣測定，以均值作為結果，計算樣品中蒽醌類成分的含量。

1.3.5 多成分含量測定。

1.3.5.1 色譜條件與系統適用性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇為流動相A，以0.5%醋酸溶液為流動相B，按表2中的規定進行梯度洗脫;流速1.0 mL/min;檢測波長280 nm;柱溫35 ℃，進樣量10 μL。

1.3.5.2 對照品溶液的制備。取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成每1 mL含沒食子酸14.02 μg、5-羥甲基糠醛26.18 μg、兒茶素17.85 μg、二苯乙烯苷333.60 μg、大黃素32.60 μg、大黃素甲醚75.24 μg的混合溶液，即得。

1.3.5.3 供試品溶液的制備。取何首烏和制何首烏粉末（四號篩）各約0.5 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇溶液30 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液即得。

1.3.5.4 線性關系的考察。分別精密吸取混合對照品溶液2、6、8、10、15 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以各待測物進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸。

1.3.5.5 精密度試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，精密吸取10 μL，按“1.3.5.1”色譜條件，重復進樣6次，分別記錄各成分峰面積的RSD。

1.3.5.6 穩定性試驗。取經2次蒸曬的制首烏供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h間隔進樣10 μL，分別記錄各成分峰面積的RSD。

1.3.5.7 重復性試驗。取經2次蒸曬的制首烏粉，按“1.3.5.3”的方法制備供試品溶液，進行含量測定，分別記錄各成分峰面積，計算各成分含量的RSD。

1.3.5.8 加樣回收率試驗。精密稱取已知含量的何首烏粉末（過四號篩）0.25 g，平行6份，按制何首烏中各成分含有量分別加入相應量的沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚，混勻，按“1.3.5.3”供試品溶液的制備方法處理，進行含量分析，計算加樣回收率。

1.3.5.9 樣品測定。分別稱取何首烏生品及九蒸九曬后的樣品，按“1.3.5.3”方法制備供試品溶液，每個樣品平行3次，進樣測定，以均值作為結果，計算樣品中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量。

2 結果與分析

2.1 二苯乙烯苷含量測定的方法學考察

2.1.1 對照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖1可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同出峰時間中均有相應的一個峰出現，且該條件下樣品中的目標峰與相鄰峰的分離度較大，空白無干擾，說明此條件適合測定二苯乙烯苷的含量。

2.1.2 線性關系的考察。以峰面積（X）為橫坐標、進樣量（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得出二苯乙烯苷回歸方程為Y=0.020 0X+0.085 2（R2=0.999 7），表明二苯乙烯苷在0.451 4～2.257 0 μg線性關系良好。

2.1.3 精密度試驗。按照“1.3.3.5”方法操作，結果發現二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性試驗。按照“1.3.3.6”方法操作，結果發現二苯乙烯苷峰面積的RSD為0.8%，表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.1.5 重復性試驗。按照“1.3.3.7”方法操作，結果發現二苯乙烯苷含量的RSD為1.3%，表明該方法重復性良好。

2.1.6 加樣回收率試驗。按照“1.3.3.8”方法操作，結果發現二苯乙烯苷平均加樣回收率為103.5%，RSD=0.6%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.2 蒽醌類含量測定的方法學考察

2.2.1 對照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖2可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同出峰時間中均有相應的峰出現，且該條件下樣品中的目標峰與相鄰峰的分離度較大，空白無干擾，說明此條件適合測定大黃素、大黃素甲醚的含量。

2.2.2 線性關系的考察。以峰面積（X）為橫坐標、進樣量（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得出大黃素回歸方程為Y=0016 1X+0.001 4（R2=1.000 0），大黃素甲醚回歸方程為Y=0.020 3X+0.000 1（R2=1.000 0），表明大黃素、大黃素甲醚分別在0.162 7～0.813 3、0.065 6～0.328 0 μg線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗。按照“1.3.4.5”方法操作，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚峰面積，結果發現大黃素的RSD分別為0.2%、0.2%，大黃素甲醚的RSD分別為0.3%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗。按照“1.3.4.6”方法操作，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚峰面積，結果發現大黃素RSD分別為0.2%、0.7%，大黃素甲醚RSD分別為0.2%、0.7%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.5 重復性試驗。按照“1.3.4.7”方法操作，分別記錄游離蒽醌及總蒽醌測定時大黃素、大黃素甲醚峰面積，結果發現大黃素RSD分別為1.1%、1.2%，大黃素甲醚RSD分別為1.3%、0.9%，表明該方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗。按照“1.3.4.8”方法操作，計算加樣回收率，結果發現大黃素和大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為97.5%、101.1%，RSD分別為1.1%、1.3%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.3 多成分含量測定的方法學考察

2.3.1 對照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖3可以看出，在相同的色譜條件下，樣品在對照品相同出峰時間中均有相應的峰出現，且該條件下樣品中的目標峰與相鄰峰的分離度較大，空白無干擾，說明此條件適合測定各成分的含量。

2.3.2 線性關系的考察。以各待測物進樣量（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，具體結果見表3，結果表明，各成分在相應的范圍內線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗。按照“1.3.5.5”方法操作，結果得出制何首烏中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.4%、0.6%、1.1%、0.2%、0.3%、0.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗。按照“1.3.5.6”方法操作，結果得出制何首烏中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.6%、0.5%、1.5%、0.3%、0.4%、0.6%，表明供試品溶液在8 h內測定，峰面積基本穩定。

2.3.5 重復性試驗。按照“1.3.5.7”方法操作，結果得出制何首烏中沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的含量平均值分別為0.196 8、0.004 7、0.159 5、9.339 7、0.888 3、1.046 9 mg/g，RSD分別為1.0%、1.9%、1.0%、1.6%、2.0%、1.3%，表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗。按照“1.3.5.8”方法操作，計算加樣回收率，結果得出制何首烏6種成分沒食子酸、5-羥甲基糠醛、兒茶素、二苯乙烯苷、大黃素、大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為100.1%、98.8%、97.0%、100.2%、102.1%、979%，RSD分別為1.4%、0.4%、0.9%、1.3%、1.0%、0.8%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.4 各指標含量測定結果 各成分的方法確定并驗證后，取不同炮制品何首烏樣品，進行各指標含量測定，結果見表4。

結果表明，隨著何首烏蒸曬次數的增加，其外觀性狀及多成分指標均產生較大影響，其中性狀表現為表面及斷面顏色逐漸加深，質地也變得堅硬;浸出物、二苯乙烯苷含量呈明顯的下降趨勢，其中九蒸九曬后二苯乙烯苷含量與生品相較，下降達58.5%，可能原因為二苯乙烯苷具有熱不穩定性，隨炮制時間的延長和溫度的升高而降低。游離蒽醌的含量則隨著蒸曬次數的增加而持續上升，較生品升高達307.9%，文獻也表明，九蒸九曬過程中大黃素和大黃素甲醚含量的增加可能與結合蒽醌的水解有關[11]。相反，結合蒽醌的含量持續下降，九蒸九曬時含量達到最低，總蒽醌含量總體緩慢上升，八蒸八曬后達最大值。多成分含量測定中，何首烏黑豆汁蒸制法中隨著蒸制時間的延長，沒食子酸含量先上升后下降，六蒸六曬時達到最高值，總體含量上升;5-羥甲基糠醛含量較低，變化不明顯;兒茶素則是持續下降;二苯乙烯苷含量減少，在一次蒸曬時達到最高點后持續下降，總體規律與藥典法測得結果相近;大黃素、大黃素甲醚隨著蒸曬次數的增加含量基本呈緩慢上升趨勢。

3 討論與結論

生品何首烏有一定副作用，使用不當可對人體造成損害，經過炮制的何首烏降低或消除了對人體的副作用，并能增強滋補功能，而近年來何首烏導致不良反應問題時有發生[12-13]，其毒性物質基礎尚不明確，對何首烏肝毒性成分的報道多以蒽醌類、芪類及鞣質類成分為主，其中以結合蒽醌在肝毒性作用中占主導地位[14-15]。何首烏作為典型的生熟異治中藥，臨床功效安全發揮很大程度上取決于炮制工藝的規范性與可靠性，經九蒸九曬后其外形、功效、成分均發生了極其復雜的變化，既有已知成分量的變化，同時存在內在成分質的改變，炮制監測過程中發現，何首烏除游離蒽醌含量增加以外，二苯乙烯苷及結合蒽醌類成分含量均呈下降趨勢，該過程物質成分的變化與其減毒機制、臨床藥效發揮是否相關聯，是何首烏質量安全性評控的難點和重點問題。同時，古法炮制中的九蒸九曬是否僅代表炮制時間長短，而非確切的蒸曬次數，仍有待考證。

飲片質量是中藥炮制過程及整個產業鏈的核心，炮制規范是保證中藥有效性、安全性的基礎，對于經臨床應用具有一定療效的傳統炮制工藝，為避免失傳，應當基于現代多學科知識、技術手段，從化學成分、藥理作用、毒副作用及臨床藥效等方面進行深入研究后，批判性繼承發揚。而傳統炮制工藝九蒸九曬與現代炮制工藝因加工設備、技術參數不同而產生新的化學成分及其與功效改變的關系，值得進一步深入研究。

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