長鏈非編碼RNA AK001058對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響

鄭雙 符竣惠 章孟 章靈敏 林峰

結直腸癌作為最常見的消化道惡性腫瘤之一，在世界范圍內有著極高的病死率[1-2]。近年來，結腸癌外科手術、化療藥物以及小分子靶向藥物治療方面取得了很大進展[3]，早期結腸癌的治療效果得到了一定程度的改善。因此，開發新的結直腸癌診斷方法，揭示結直腸癌的發病機制是結直腸癌基礎研究領域現階段的重點問題。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）通常指長度超過200nt的非編碼RNA。LncRNA的堿基在長度和結構上與信使RNA（messenger RNA,mRNA）非常類似，但由于缺少開放閱讀框（open reading frame,ORF）而不能被編碼翻譯成蛋白。越來越多的研究表明，lncRNA非但不是在生物進化過程中的基因冗余，而且在個體發育和癌癥等疾病的發展過程中發揮了重要的作用[4]。因此，以lncRNA作為新的腫瘤標志物及抗腫瘤藥物靶點的研究成為最近腫瘤生物學領域的熱點問題。AK001058是最近發現的與癌癥相關的lncRNA，其在胃癌、結腸癌組織中表達上調[5-6]，但在腫瘤發生（尤其是結腸癌）中的作用還缺少深入的研究。在本文中，筆者研究lncRNA AK001058在結腸癌組織中的表達及其對結腸癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 收集2017年7月至2018年10月本院3例結腸癌手術患者（TNM分期Ⅱ~Ⅲ級，未發生遠處轉移）的結腸癌組織和癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣≥5cm）。人結腸癌細胞系SW480購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；FBS（500ml，批號：10099-141）和 DMEM 培養基（500ml，批號：11965-092）、消化細胞所用的 PBS（500ml，批號：14190-144）和 0.25%胰蛋白酶（500ml，批號：25200072）、轉染細胞所用的 Opti-MEM 培養基（500ml，批號：31985062）和 Lipofectamine RNAiMAX（0.75ml，批號：13778150）轉染試劑均購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染 根據轉染試劑說明書，轉染前1d將細胞接種于12孔板中，直到細胞融合度達到60%~80%時進行轉染。在準備好的2管Opti-MEM中分別加入1μl siRNA和 1μl Lipofectamine RNAiMAX，然后將稀釋的混合液于室溫靜置5min，采用懸滴法將其加入細胞，48h后進行檢測。根據AK001058核苷酸序列設計了兩條siRNAs即siRNA-1和siRNA-2，并使用靶向熒光素酶（luciferase）的siRNA作為對照siRNA，其引物序列信息見表1。

表1 siRNAs序列

1.2.2 癌組織和SW480細胞AK001058的表達 采用Trizol法提取組織或細胞總RNA，測定濃度之后將其反轉錄為 cDNA，然后利用 SYBR Premix Ex Tag（Takara）在ABI 7500儀器上進行實時定量熒光PCR檢測，反應程序設為 95℃預變性 5min，95℃變性 15s、65℃退火 15s、72℃延伸30s共35個循環。AK001058及內參基因U6引物見表2。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.2.3 細胞增殖活性檢測 將消化好的細胞制成濃度為1×106/ml的細胞懸液，取100μl加入96孔板中，每個樣品設置5個復孔。細胞培養24h待細胞貼壁后，轉染對照 siRNA 和 siRNA-1、siRNA-2，并在轉染 0、24、48、72和96h 5個時點加入含CCK-8的培養基（約占原培養基體積的10%），37℃孵育4h，待顏色變橙色后拿出來放置在酶標儀上進行檢測。

1.2.4細胞凋亡率檢測 采用Annexin V/PI雙染法。轉染對照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細胞培養48h后，使用0.25%Tripsin/EDTA消化細胞，并收集細胞用PBS重懸，調整細胞密度為1×106/ml。然后取500μl樣品加入 5μl Annexin V-FITC 和 5μl碘化丙啶（PI），輕輕混勻后室溫避光孵育10min，隨后使用流式細胞儀進行檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織和癌旁組織中AK001058表達水平的比較 與癌旁組織中AK001058的表達水平（1.00±0.12）相比，結腸癌組織中的（2.58±0.37）明顯上調，差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 對照siRNA、siRNA-1和siRNA-2 AK001058表達水平的比較 與對照siRNA的細胞中AK001058的表達水平（1.00±0.00）相比，siRNA-1（0.62±0.09）和 siRNA-2（0.54±0.05）的均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.3 對照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細胞增殖活性比較 與對照siRNA的細胞相比，在轉染后24、48h，siRNA-1和siRNA-2的細胞增殖活性相對較低，但差異均無統計學意義（均P＞0.05）；而隨著細胞培養時間的延長，在轉染72、96h，siRNA-1和siRNA-2的細胞增殖活性均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 3。

表3 對照siRNA、siRNA-1和siRNA-2的SW480細胞增殖活性比較

2.4 對照siRNA、siRNA-2和siRNA-2的SW480細胞凋亡率的比較與對照siRNA的細胞凋亡率[（2.60±0.72）%]相比，轉染siRNA-1[（6.81±2.01）%]和siRNA-2[（9.23±2.53）%]的均上升，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

3 討論

開發新的腫瘤標志物和藥物靶點是當前結腸癌基礎研究領域的熱點問題。近年來，lncRNA在腫瘤發生中的作用受到越來越多的關注。在結腸癌的研究中，已經發現了一系列具有重要作用的lncRNA會在腫瘤發生過程中出現異常表達，有些（如 CCAT1[7]、CCAT2[8]、MYLKP1[9]等）在結腸癌組織中表達上調，表現出原癌基因的特性，促進癌細胞的增殖和轉移，而有些則在癌組織中呈現低表達，發揮抑癌基因的作用[4]。Niu等[6]發現了AK001058在人結腸癌組織中表達水平上調，但其在腫瘤發生中的作用卻沒有進行深入的研究。在本研究中，筆者同樣使用結腸癌病理組織樣品，采用實時定量熒光PCR法驗證了AK001058在結腸癌組織中的表達水平，結果顯示AK001058在結腸癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，該結果提示AK001058可能在結腸癌發生、發展過程中具有重要的生理意義。進一步以結腸癌細胞系SW480為研究對象，發現下調AK001058的表達會抑制結腸癌細胞的增殖并促進細胞走向凋亡。這些結果表明在結腸癌腫瘤發生的過程中，AK001058發揮了促進細胞增殖、抑制細胞凋亡的作用。

lncRNA并不具有轉錄活性，卻可以通過與特定的蛋白、DNA或RNA結合，調控靶基因的轉錄活性或者作為骨架聯系多種蛋白形成核糖核蛋白復合體，從而實現對細胞生理功能的調控[10]。已有的研究表明，在腫瘤發生過程中，lncRNA可以直接參與基因轉錄調控腫瘤相關基因的表達，如DNA損傷活化P21相關非編碼RNA（P21 associated ncRNA DNA damage activated，PANDA）可以與轉錄因子NF-YA結合從而抑制DNA損傷引起的細胞凋亡[11]。而在肝癌中，過表達PANDA也促進了癌細胞的增殖[12]。lncRNA還可以在轉錄后水平調控基因的表達，如基因間長非編碼RNA-RoR（Linc-RoR）可以與核不均一核糖核蛋白（hnRNP）及AU富集元件RNA結合蛋白1（AUF1）相互作用，影響癌基因c-myc mRNA的穩定性[13]。此外，越來越多的研究也發現了lncRNA參與了諸如 p53[14]、NF-κB[15-16]、PI3K/AKT[17]及 Notch[18]等多條腫瘤相關的信號通路的調控作用，表明lncRNA可以多維度參與腫瘤發生的調控。

本研究結果提示了lncRNA AK001058對結腸癌細胞增殖和凋亡的調控作用，但未深入研究其調控的下游基因以及信號通路，因此AK001058在結腸癌細胞中具體作用的分子機制還有待進一步探究。