血必凈對兔急性肺損傷的早期保護作用及其機制研究

賀慧博 郝建 楊煒

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）和急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory disease syndrome，ARDS）是同一疾病過程的兩個階段，是指由各種肺內、肺外因素導致的急性彌漫性肺損傷和進而發展的急性呼吸衰竭，是臨床常見危重癥，病死率高達30%~50%[1]。ALI的發病本質是各種肺內、肺外致病因素引起肺部炎癥細胞（中性粒細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等）反應，大量炎癥細胞因子（TNF-α、IL-1等）在肺中激活、聚集，異常升高的細胞因子與過度激活的免疫細胞、中性粒細胞、巨噬細胞之間形成正反饋機制，最終造成肺組織中炎癥反應失控，肺毛細血管內皮細胞以及肺泡上皮細胞彌漫性損傷，大量滲出液聚集使氣道阻塞，臨床表現為急性非心源性肺水腫和頑固性低氧血癥（PaO2/FiO2≤300mmHg）[2-3]。爆炸傷是 ALI的常見致病因素，無論是戰爭，還是生活、生產過程中，爆炸事故頻發。爆炸產生的沖擊波、高溫、有毒有害氣體等因素極易造成肺實質、肺間質的損傷，進而引起多種炎癥細胞的反應、炎性介質釋放、血管通透性改變等，最終造成ALI。目前爆炸制備家兔急性肺損傷實驗模型方法成熟，且能很好復制ALI狀態[4-5]。血必凈是紅花、丹參、赤芍、當歸、川芎等提取物制成的中藥復合制劑，主要成分是紅花黃色素A，臨床主要用于因感染、燒傷、創傷等引起的局部或全身炎癥反應及多器官功能衰竭綜合征的早期治療。研究表明，血必凈能夠有效地拮抗內毒素、抑制TNF-α、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8 等內源性炎性介質的過度釋放，增強機體免疫，改善微循環等[6]。本研究通過爆炸制備家兔急性肺損傷模型，探討血必凈對抑制ALI早期急性炎癥反應的作用機制，為臨床ALI的治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑與儀器 血必凈注射液（10ml/支）購自天津紅日藥業；地塞米松磷酸鈉注射液（5mg/支）購自山西晉新雙鶴藥業；ELISA試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；核轉錄因子NF-κB Western blot試劑盒（148G3026）、基質金屬蛋白酶（MMP-9）Western blot試劑盒（217K2185）均購自美國Sigma公司；逆轉錄試劑盒（00145205）購自美國Thermo公司；ActinTA-09（150527）、山羊抗小鼠IgG ZB2305（109145）、山羊抗兔IgG ZB2301（109525）均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；引物合成設備及Trizol（14105）購自美國Invitrogen公司。

1.2 實驗動物 普通清潔級家兔40只，雌雄各半，體重（2.25±0.25）kg，購于安徽長臨河醫藥科技有限公司，合格證號 scxk（皖）2006-002。

1.3 方法

1.3.1 分組 將40只家兔按隨機數字表法分為血必凈低劑量（L）組、高劑量（H）組、地塞米松（D）組、氯化鈉注射液對照（N）組及ALI模型（A）組5組，每組8只。除了N組外其他組均進行ALI模型制備，造模成功后L、H組分別給予10、20ml/kg的血必凈注射液；D組給予0.5ml/kg地塞米松注射液（1mg/ml）；N、A組給予10ml/kg氯化鈉注射液。各組于實驗前禁食12h，禁水4h。

1.3.2 ALI模型制備 依據相關文獻，采用空中爆炸法制備ALI模型[4-5]。將家兔胸部脫毛，雙耳備皮、塞入棉球，固定于支架，置于鋼質保護箱（保護箱于家兔胸部位置有一開口，大小可調，控制實驗時暴露部分僅為家兔胸部，其余身體部位均在箱體內）。將鋼制保護箱放置于空中爆炸場并固定。爆炸裝置為35g球形工業炸藥，藥心與家兔胸部中心點同一水平，水平距離35cm，引爆裝置為8號雷管。在距離炸藥藥心水平線35cm的另一側安置空中壓力傳感器，用于監測點處壓力時程曲線，爆炸程序由專業人員操作。爆炸后，立即對爆炸場內抽風排氣，迅速轉移實驗樣本于安全通風環境下，進行簡單處理（清創縫合傷口，保持呼吸道通暢等），觀察并記錄其生命體征。造模成功后，各組家兔給予相應藥物處理，24h后，家兔麻醉、抽血、取材。本研究中涉及家兔相關處置均通過安徽醫科大學倫理委員會批準。

1.3.3 檢測指標

1.3.3.1 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量測定 采用ELISA法。取家兔耳緣靜脈血，常溫3 000r/min離心10min，取上清液于-80℃液氮罐保存。ELISA法檢測按說明書操作。

1.3.3.2 肺濕干重比（W/D） 麻醉后取右肺中葉肺組織2.5g左右，吸干表面雜質，稱取濕重后，再置于80℃烘箱72h至烘干，稱取干重，計算比值。

1.3.3.3 肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平測定 采用Western blot法。麻醉后取右肺上葉部分肺組織100mg左右，稱重，剪碎，液氮研磨，加入RIPA細胞裂解液1ml，12 000r/min離心10min，取上清液，即含有組織總蛋白，采用Western blot法進行測定，相關方法步驟嚴格參照說明書進行。

1.3.3.4 肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平測定采用RT-PCR法。取右肺上葉肺組織樣本，稱重，剪碎，液氮研磨，加入1ml Trizol勻漿于4℃、12 000r/min離心10min。采用Trizol法獲取總RNA，逆轉錄成cDNA,再行熒光定量PCR反應。實驗采用相對定量研究法法進行分析，分析采取的指標為：2-ΔΔCt。實驗使用的上游引物序列為：5′-TGGTCAGCTCCCTTCTCTGT-3′，下游引物為：5′-TACCTCCAGCCTGCTTCTGT-3′。相關方法步驟嚴格參照說明書進行。

1.3.3.5 肺組織病理學觀察 肺組織用10%甲醛固定，石蠟包埋，切片4~5μm厚，HE染色，光鏡下觀察其病理改變。并采用Smith肺損傷病理評分[7]進行評價：沒有損傷為0分；輕度損傷、間質水腫和局限性壞死、病變范圍＜25%為1分；中度損傷、廣泛的肺臟細胞腫脹和壞死、或病變范圍25%～50%為2分；嚴重損傷、有毛細血管內皮腫脹、細胞間隙增寬、大量炎性細胞浸潤和肺臟萎縮的壞死，或病變范圍51%～75%為3分；極嚴重的損傷、彌漫性血管損傷、出血和肺臟壞死，或病變范圍76%～100%為4分。累加每組家兔的分數，并計算出平均分值，分值越高提示該組家兔炎癥病變程度越重。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0統計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5 組家兔血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 含量及肺 W/D 值比較 L、H、D、A 組 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10及W/D值均比N組高（均P＜0.05）；L、H、D組TNF-α、IL-1β、IL-6及W/D值均比A組低，其中H組降低最明顯，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而L、H 、D組IL-10含量均高于A組，其中H組升高明顯，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表 1。

2.2 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平比較 肺組織NF-κB、MMP-9蛋白表達水平以A組最高，而L、D、H組依次降低，H組降低最顯著，見圖1。

2.3 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平的比較 L、H、D、A 組 NF-κB、MMP-9 mRNA 的表達水平均比N組高（均P＜0.05），L、H、D組則均比A組低，其中以H組降低最明顯，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖 2、表 2。

2.4 5組家兔肺組織病理變化 N組未見明顯改變，其余各組肉眼可見肺體積變大，表面散在瘀斑，部分組織切面可見紅色實樣變，伴有泡沫樣滲出。光鏡下見肺泡壁充血，間質水腫，肺泡腔相對狹窄，伴炎癥細胞浸潤，可見出血、滲出等。L、H、D組較A組改變相對較輕，其炎性浸潤等較少、且肺泡壁充血相對改善，其中以H組改善最明顯，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表3、圖3。

3 討論

實驗前，各組家兔呼吸、心率等生命體征均平穩，無煩躁不安、意識異常等情況。爆炸致傷后，各組家兔呼吸淺快，活動后出現呼吸窘迫、點頭呼吸等現象，口唇等皮膚黏膜相繼出現發紺，口鼻分泌物增多，肺部聽診有明顯濕啰音，甚至少數家兔出現短暫昏迷，提示出現呼吸功能不全。爆炸致傷后，肉眼可見家兔肺體積變大，表面散在瘀斑，部分組織切面可見紅色實樣變，切面可伴有泡沫樣滲出。光鏡下見肺泡壁充血，間質水腫，肺泡腔相對狹窄，伴炎癥細胞浸潤，可見出血、滲出等。爆炸損傷肺實質、肺間質，引起多種炎癥細胞的反應、炎性介質釋放、血管通透性改變，肺順應性改變等，進而引起肺通氣血流比例失調，出現呼吸困難等現象。L、D、H、A組均出現以上現象，但以H組改變相對最輕。本實驗顯示，爆炸后各組家兔呼吸加快、呼吸困難、煩躁不安，口鼻分泌物增多，昏迷，肺部啰音等，W/D比值明顯升高，血氣PaO2/FiO2≤300mmHg，且肺病理學改變符合ALI病理變化標準，提示造模成功、有效[8]。

ALI發病機制復雜，肺或全身炎癥反應失控被認為是ALI/ARDS的主要發病機制。爆炸傷后，炎癥介質尤其是TNF-α、IL-1、IL-6等“早期反應細胞因子”大量釋放，從而誘發炎癥級聯反應。其中促炎細胞因子（主要包括 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）和抗炎細胞因子（主要有IL-4、IL-10、IL-1受體拮抗劑等）失衡在發病過程中起重要作用[9]。IL-1β在ALI發病中能誘導中性粒細胞和單核/巨噬細胞趨化，產生多種趨化因子如IL-8、MCP-1等，最終導致炎癥浸潤。而TNF-α能誘導白細胞遷移、粒細胞脫顆粒、肺內皮細胞活化、和毛細血管滲透性增加，促進水腫液形成，影響肺泡氣體交換，造成低氧血癥等；此外，TNF-α還與其他細胞因子形成作用網絡促進ALI的發生、發展[10]。而IL-10是一個以免疫抑制為主的多向免疫調節因子，其主要生物活性表現為直接抑制炎癥細胞活化，可抑制IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、TNF 等表達[11]。實驗結果顯示，造模成功后，L、H、D、A組血清 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 表達均比 N 組高；A組TNF-α、IL-1β、IL-6表達均高于 L、D、H 組；而 A 組IL-10的表達低于L、D、H組；其中均以H組變化最明顯。提示TNF-α、IL-1β、IL-6是ALI重要的促炎介質，而IL-10在體內發揮著重要的抗炎作用，且血必凈、地塞米松對肺損傷都有保護作用，但以H組最明顯。

表1 5組家兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量及肺W/D值比較

圖1 5組家兔NF-κB、MMP-9蛋白表達電泳圖

圖 2 5組家兔 NF-κB、MMP-9 mRNA 的擴增、熔解曲線（a：NF-κB mRNA 的擴增曲線；b：NF-κB mRNA 的熔解曲線；c：MMP-9 mRNA的擴增曲線；d:MMP-9 mRNA的熔解曲線）

表2 5組家兔肺組織NF-κB、MMP-9 mRNA表達水平的比較

表3 5組家兔肺組織病理評分（分）

圖3 5組家兔組織病理學結果（a:N組；b:A組；c:L組；d:D組；e:H組；HE染色，×400）

NF-κB是參與調控機體多種免疫、炎癥反應和應激的早期快反應基因表達的一種核蛋白因子。爆炸致傷家兔后，激活NF-κB，核易位增加，啟動TNF-α等表達，釋放的TNF-α等與創傷一起進一步易化NF-κB的活化[12]，基于以上觀點NF-κB可能是失控炎癥基因表達的調控點。本實驗結果顯示，造模后L、D、H組較A組NF-κB表達量降低，以H組變化最明顯。因此推測血必凈可能有抑制NF-κB表達、減輕炎癥反應的作用。MMP-9是MMPs家族中的一員，研究表明，MMP-9在正常肺組織細胞中只產生極微量的MMP-9，一旦發生ALI，MMP-9表達量急劇上升[13]。且MMP-9與肺損傷程度正相關[14]。且MMP-9對多種促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等）發揮正反饋作用。因此有學者指出MMP-9是影響ALI發生、發展的重要機制之一，抑制MMP-9的表達活性有望成為救治ALI的新途徑。本實驗結果同樣提示，造模后L、D、H組MMP-9表達量均較A組有不同程度降低，且降低程度與病理改變趨勢基本一致，且以H組變化最顯著，與相關研究結果類似，即MMP-9可以一定程度提示肺損傷程度。

血必凈是紅花、丹參、赤芍、當歸、川芎等提取物制成的中藥復合制劑，主要有效成分為紅花黃色素A等物質。研究表明血必凈注射液對創傷、感染等導致的ALI模型有較好的功效，能有效拮抗內源性炎癥介質的作用，抑制炎癥因子的產生及作用[6，15]。臨床主要用于因感染、燒傷、創傷等引起的局部或全身炎癥反應及引起的多器官功能衰竭綜合征的早期治療。本次實驗結果顯示，ALI模型，L、D、H、A 組 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達量及W/D均比N組高。經血必凈治療后，L、H 組 MMP-9、NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6 表達量及W/D均比A組低，IL-10表達量則均比A組高，其中均以H組改變最顯著。且肺病理切片顯示血必凈治療后肺組織損傷明顯減輕。提示血必凈注射液可以通過下調 MMP-9、NF-κB 的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6活性，增強IL-10活性，從而抑制炎癥反應，抑制細胞早期急性炎癥反應，阻斷細胞因子級聯反應，從而起到對家兔ALI的保護作用。

綜上所述，爆炸致傷家兔可以成功復制ALI模型。血必凈注射液可以通過下調MMP-9、NF-κB的激活，抑制 TNF-α、IL-1β、IL-6 活性，增強 IL-10 活性，抑制細胞早期急性炎癥反應，從而發揮其對爆炸致家兔ALI的保護作用。