阿托伐他汀抑制動脈粥樣硬化患者NLRP3炎性體途徑的研究

李奕萍 王紅琴 王健 鄭文華 陳建忠

動脈粥樣硬化（AS）多由脂肪代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)引起，常導(dǎo)致血栓形成、供血障礙等，也是冠心病等心血管疾病的首要病因。目前研究表明，AS是一種慢性炎性疾病，炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用[1]，尤其是免疫應(yīng)答介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[2]。有學者提出含熱蛋白結(jié)構(gòu)域3的核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLRP3）炎性體激活途徑[3]在AS發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵的作用[4-5]。他汀類藥物是冠心病、高血壓以及腦血管病的預(yù)防藥物，其中阿托伐他汀進入體內(nèi)不需代謝即可有生物活性，具有見效快、降脂作用強以及持續(xù)時間長等優(yōu)點，可有效降低心血管疾病的發(fā)病率和病死率。阿托伐他汀治療心血管疾病的原理在于它可抑制內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞以及巨噬細胞（MDM）的增殖和轉(zhuǎn)移，但其對NLRP3炎性體的調(diào)節(jié)作用報道較少。本研究通過觀察阿托伐他汀治療前后AS患者NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達和IL-1β、IL-18等細胞因子的變化，以及體外阿托伐他汀對NLRP3炎性體活化途徑的調(diào)節(jié)作用，探討阿托伐他汀治療AS的免疫學機制。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2015年1月至2016年12月在本院診治的AS患者30例，均經(jīng)超聲檢查確診。入選標準：（1）經(jīng)超聲檢查確診為AS，即血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)-中膜厚度1.0~1.2mm或管腔內(nèi)粥樣硬化斑塊形成、管腔狹窄；（2）既往未接受過阿托伐他汀類藥物治療。排除標準：（1）有急性感染的臨床表現(xiàn)；（2）嚴重腎功能衰竭；（3）患有痛風、類風濕疾病、糖尿病、惡性腫瘤或其他嚴重消耗性疾病；（4）長期服用激素或免疫抑制劑。患者中男 18 例，女 12 例；年齡 50~81（70.1±8.6）歲；收縮壓（SBP）為（125.56±18.98）mmHg，舒 張 壓（DBP）為（82.39±8.09）mmHg，空腹血糖 （5.98±2.14）mmol/L，TC（5.21±1.09）mmol/L，HDL-C 為（1.38±0.41）mmol/L，LDLC 為（3.07±0.88）mmol/L，TG 為（1.96±1.16）mmol/L。

1.2 主要試劑和儀器 立普妥（阿托伐他汀鈣片）購自美國輝瑞制藥有限公司，（規(guī)格：20mg/片，批號：M91692）；淋巴細胞分離液購自挪威Stem cell公司，脂多糖（LPS）、膽固醇、佛波酯（PMA）均購自美國 Sigma-Aldrich公司，IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司，Trizol試劑盒和SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒均購自江蘇康為世紀生物科技有限公司，尼日利亞菌素購自美國Invivogen公司，NLRP3、ASC、IL-1β引物自行設(shè)計后由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成，定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

1.3 IL-1β和IL-18在血漿和單核細胞來源的MDM中表達水平的檢測 采用ELISA法。患者在阿托伐他汀治療（20mg/d，口服）前1d以及治療后2個月分別采集空腹靜脈血10ml，肝素抗凝，以1 200r/min離心10min，收集血漿于試管中，-80℃冰箱保存待檢；將分離血漿后的剩余細胞用PBS稀釋1倍后，加入含淋巴細胞分離液的離心管中，采用密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，單個核細胞再分化為MDM，用膽固醇結(jié)晶刺激，收集細胞懸液上清液于試管中，-80℃冰箱保存待檢。IL-1β和IL-18表達水平檢測按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀測定450nm處吸光度（A）值，以試劑盒提供的標準品測定結(jié)果繪制標準曲線，計算IL-1β和IL-18的表達水平。

1.4 NLRP3炎性體相關(guān)分子和IL-1β mRNA表達水平的檢測 采用實時熒光定量PCR法。將MDM根據(jù)Trizol試劑盒說明書提取總RNA，加入20μl的焦碳酸二乙酯水溶解，測定RNA的濃度和OD比值，符合要求后按照SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，20μl反應(yīng)體系中包括 dNTP mix 4μl，SuperRT 1μl，5×RT Buffer 4μl，RNA 2μl，引物 2μ1，DEPC水7μl，反應(yīng)物4℃儲存待用。實時熒光定量PCR根據(jù)參考文獻進行，20μl反應(yīng)體系中含 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×）10μl，PCR 上游和下游引物各 1μl，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（cDNA 溶液）2μl，DEPC 水 6μl，在定量 PCR 儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為 95℃，30s；95℃，5s；60℃，34s，40個循環(huán)，每個樣品設(shè)定3個復(fù)孔，并使用溶解曲線分析引物特異性。用2-ΔΔCt法計算出每組樣本的mRNA表達量，每種檢測重復(fù)3次。引物根據(jù)文獻報道設(shè)計和合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 阿托伐他汀對單核巨噬細胞株（THP-1）NLRP3炎性體激活的調(diào)節(jié)作用 THP-1細胞用50nM PMA處理24h分化為MDM。為觀察不同濃度阿托伐他汀對NLRP3炎性體激活途徑的影響，用尼日利亞菌素單獨或聯(lián)合不同濃度阿托伐他汀處理細胞30min，分組如下：單獨尼日利亞菌素處理組為對照組，尼日利亞菌素聯(lián)合1μmol/L阿托伐他汀處理組為低濃度組，尼日利亞菌素聯(lián)合10μmol/L阿托伐他汀處理組為中濃度組，尼日利亞菌素聯(lián)合20μmol/L阿托伐他汀處理組為高濃度組。為觀察阿托伐他汀處理時間對NLRP3炎性體激活途徑的影響，用尼日利亞菌素單獨或聯(lián)合10μmol/L濃度阿托伐他汀不同時間處理細胞，分組如下：單獨尼日利亞菌素處理組為對照組，尼日利亞菌素聯(lián)合10μmol/L阿托伐他汀處理12、24、48h為12h組、24h組、48h組。具體操作流程：在用10μmol/L阿托伐他汀處理MDM不同時間后，加入10μmol/L的尼日利亞菌素作用30min，收集細胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β和IL-18的表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗。P＜0.05為統(tǒng)計學有意義。

2 結(jié)果

2.1 AS患者治療前后血漿中IL-1β、IL-18表達水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，IL-1β和IL-18在血漿中的表達水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表2。

表2 30例AS患者治療前后血漿中IL-1β、IL-18表達水平的比較（pg/ml）

2.2 AS患者治療前后MDM中IL-1β、IL-18表達水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，IL-1β、IL-18在MDM中的表達水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 30例AS患者治療前后MDM中IL-1β、IL-18表達水平的比較（pg/ml）

2.3 AS患者治療前后NLRP3、ASC和IL-1β mRNA表達水平的比較 30例AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后，MDM中NLRP3、ASC、IL-1β的mRNA表達水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 30例AS患者治療前后NLRP3炎性體相關(guān)分子mRNA表達水平的比較

2.4 阿托伐他汀不同濃度與不同處理時間對THP-1細胞分泌IL-1β、IL-18抑制作用的比較 與對照組比較，低、中、高濃度組IL-1β和IL-18的表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且隨著阿托伐他汀濃度越大，下降越明顯，見表5。與對照組比較，12、24、48h組IL-1β和IL-18的表達水平均下降，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且隨著處理時間越長，下降越明顯，見表6。

表5 不同濃度阿托伐他汀對THP-1細胞分泌IL-1β、IL-18 的抑制作用（pg/ml）

表6 不同時間阿托伐他汀處理對THP-1細胞分泌IL-1β和IL-18的抑制作用（pg/ml）

3 討論

AS是一種以脂質(zhì)沉積、白細胞浸潤和血管平滑肌細胞增殖為主要特征的慢性炎癥性疾病，但是到目前為止，導(dǎo)致AS發(fā)生的分子機制尚未完全闡明[1]，但免疫應(yīng)答引起的炎癥反應(yīng)與其密切相關(guān)[2]。近年來研究表明，損傷的組織和細胞產(chǎn)生的損傷/危險相關(guān)分子模式（DAMPs）能被模式識別受體（PRR）識別后介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。這些模式識別受體包括Toll樣受體（TLR）、核苷酸結(jié)合寡聚化樣受體（NLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因樣受體（RLR）和C型凝集素樣受體（CLR）等，其中NLR識別DAMPs后能形成由NLR、接頭蛋白ASC、Caspase-1等形成的稱為炎性體的分子的復(fù)合物[3]。炎性體形成后能激活Caspase-1，活化的Caspase-1繼而通過酶切IL-1β和IL-18前體分子而生成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，進而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。NLRP3炎性體是研究最多的一種，NLRP3炎性體由NLRP3、ASC和Caspase-1組成的[4]。多種內(nèi)源性刺激物如膽固醇結(jié)晶、葡萄糖、游離脂肪酸、尿酸鈉（MSU）結(jié)晶及胞質(zhì)外ATP和外源性刺激物如細菌、病毒等成分均能誘導(dǎo)NLPR3的活化，通過誘導(dǎo)促炎性細胞因子如IL-1β的產(chǎn)生，其在AS[4-6]、糖尿病[7]、阿爾茨海默病[8]、痛風[9]等免疫炎癥性疾病中的作用日益受到重視。

近年來研究發(fā)現(xiàn)固有免疫細胞如MDM、內(nèi)皮細胞吞噬游離脂肪酸（FFA）、膽固醇結(jié)晶后，可激活炎性體途徑，釋放炎癥因子如IL-1β、TNF-α等，在AS的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用[4-6]。如研究發(fā)現(xiàn)膽固醇結(jié)晶能激活MDM炎性體的形成，并發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白能促進膽固醇結(jié)晶的形成并作為初始信號促進NLRP3和IL-1β的表達[5]。本課題早期研究[6]與相關(guān)報道均發(fā)現(xiàn)，AS患者血漿中的IL-1β和IL-18的水平顯著高于對照組，其中分離的外周血單個核細胞進一步分化為MDM，定量 PCR 法檢測發(fā)現(xiàn) NLRP3、ASC、IL-1β 的mRNA表達顯著高于對照組，用一定濃度的膽固醇結(jié)晶刺激后發(fā)現(xiàn)AS患者的MDM的TNF-α、IL-1β的分泌水平均顯著高于對照組，提示AS患者可能存在慢性低度炎癥狀態(tài)，NLRP3炎性體激活與AS的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。此外，AS患者的大動脈[10]、頸動脈硬化斑塊[11]和皮下脂肪組織[12]中均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性體相關(guān)分子如NLRP3、ASC等表達升高，且與疾病的嚴重性相關(guān)。文獻報道，NLRP3炎性體激活可導(dǎo)致消皮素D（GSDMD）分子的活化，后者可在細胞膜上形成孔道，有利于促進IL-1β的分泌[13]，在AS患者中GSDMD是否表達升高目前還沒有報道，但由于活化的GSDMD是IL-1β分泌的必需成分，推測可能與其活性升高密切相關(guān)。以上結(jié)果提示由膽固醇結(jié)晶刺激引起的NLRP3炎性體激活途徑可能在AS的發(fā)生、發(fā)展中起到重要的作用。有關(guān)膽固醇結(jié)晶激活NLRP3炎性體的分子機制，有學者推測膽固醇結(jié)晶被MDM吞噬后可導(dǎo)致吞噬溶酶體的不穩(wěn)定性或破裂，引起溶酶體的組織蛋白酶B釋放激活NLRP3 炎性體[4-5]。

他汀類藥物是一類羥甲基戊二酰輔酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A，HMG-CoA） 還原酶抑制劑，因其降脂作用強效、穩(wěn)定、安全，臨床上已被廣泛用于高脂血癥的治療與預(yù)防[14-15]。近來的臨床研究大量數(shù)據(jù)已經(jīng)證明他汀類藥物在冠心病患者中除有降脂作用外還具有改善內(nèi)皮功能、穩(wěn)定斑塊及抗AS的作用，其中上述作用機制的分子機制涉及到他汀類藥物的抗炎作用[14]。C-反應(yīng)蛋白（CRP）是反應(yīng)機體炎癥的敏感治療，近期有研究顯示，冠心病患者在使用阿托伐他汀后，CRP水平明顯下降，表明阿托伐他汀具有抗炎效應(yīng)[14]，但其調(diào)控機制不甚清楚。另外，在對心力衰竭的患者研究中發(fā)現(xiàn)，他汀藥物具有降低血清中細胞炎癥因子的效應(yīng)，從而發(fā)揮抗炎作用。隨著NLRP3炎性體在AS發(fā)病中的作用被揭示，其在臨床治療中相關(guān)性日益受到關(guān)注，如研究報道急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛患者經(jīng)高劑量的瑞舒伐他汀鈣片（20mg/d）治療4周后，血漿中IL-1β和IL-18水平顯著下降[16]，但也有報道冠心病患者在經(jīng)瑞舒伐他汀治療8個月后，NLRP3炎性體相關(guān)分子表達和血漿中IL-1β和IL-18水平?jīng)]有變化，但是阿托伐他汀治療能引起IL-1β和IL-18顯著下降[17]，這些結(jié)果不一致可能與劑量和觀察時間不同有一定的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療一段時間后，血漿中IL-1β和IL-18下降，NLRP3炎性體相關(guān)分子如NLRP3、ASC等表達也降低，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，一定濃度的阿托伐他汀藥物能抑制經(jīng)尼日利亞菌素刺激后THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18，且呈劑量依賴性，表明阿托伐他汀藥物在體內(nèi)可能對膽固醇結(jié)晶誘導(dǎo)的炎性體激活具有抑制作用，從而在AS的治療中發(fā)揮作用。有學者報道阿托伐他汀藥物能通過抑制TLR4-MyD88-NF-κB信號途徑抑制THP-1細胞中NLRP3炎性體激活[18]，另有研究發(fā)現(xiàn)PKA能通過引起NLRP3蛋白291絲氨酸位點磷酸化和泛素化修飾抑制NLRP3炎性體的激活，從而改善炎癥性疾病的病理發(fā)生[17]，而早期文獻報道阿托伐他汀能通過激活PKA抑制葡萄糖反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的功能[20]，目前本研究團隊正在研究阿托伐他汀是否也能通過激活PKA而抑制NLRP3炎性體激活。

本研究發(fā)現(xiàn)AS患者經(jīng)阿托伐他汀治療后血漿IL-1β和IL-18水平顯著下降，同時MDM中NLRP3炎性體相關(guān)分子的表達水平和膽固醇結(jié)晶刺激后MDM產(chǎn)生IL-1β和IL-18的水平經(jīng)治療后也顯著降低，體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀藥物能抑制尼日利亞菌素刺激THP-1細胞產(chǎn)生IL-1β和IL-18，提示阿托伐他汀在體內(nèi)可能通過抑制NLRP3炎性體的激活而在AS的治療中發(fā)揮作用，本研究結(jié)果為進一步研制開發(fā)有效的AS治療藥物提供了一定的思路。

（收稿日期：2017-08-28）

（本文編輯：俞駿文）