高危型HPV陽性患者血清m iRNA-26a表達水平對宮頸癌的預測價值

劉曼曼，李 靜，王金銘，張 展，杜明澤，王碧君，管一春，劉朝朝

11)鄭州大學第三附屬醫院生殖中心鄭州450052 2)鄭州大學第三附屬醫院婦產科鄭州450052 3)鄭州大學第三附屬醫院檢驗科鄭州450052

宮頸癌，又稱子宮頸癌，是常見的婦科惡性腫瘤，約占女性癌癥死亡總數的8%，約80%的宮頸癌發生在發展中國家［1-2］。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)屬于乳頭多瘤空泡病毒科乳頭瘤病毒屬。高危型別HPV(如HPV16、18)的持續感染是促使宮頸癌發生的最重要因素［2-3］。miR-26a是最近發現的一種miRNA，本課題組的前期研究［4］已證實在HPV18陽性的宮頸癌HeLa細胞和HPV16陽性的宮頸癌SiHa細胞中，miR-26a能夠通過靶向調控高遷移率蛋白A1基因(high mobility protein A1，HMGA1)的表達，抑制宮頸癌細胞的遷移和侵襲，參與宮頸癌的發生發展。本研究檢測了miR-26a在HPV高危型宮頸癌患者癌組織和血清中的表達水平，探討血清miR-26a表達水平對宮頸癌的預測價值。

1 對象與方法

1．1 研究對象 收集2014年12月至2018年10月在我院就診的HPV16和(或)HPV18陽性的宮頸癌患者50例作為病例組，患者入院后行宮頸活檢或行筋膜外/廣泛性子宮切除術，術前均未接受放、化療;FIGO分期Ⅰ、Ⅱ期31例，Ⅲ、Ⅳ19例;鱗癌43例，腺癌7例;臨床分級中高分化35例，低分化15例。收集同期HPV16和(或)HPV18陽性、因良性病變(如子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮內膜息肉等)行子宮全切或宮頸活檢的非宮頸癌患者50例作為對照組。兩組臨床基本資料比較，差異無統計學意義(表1)。本研究已經通過醫院倫理委員會批準，患者均簽署了知情同意書。

表1 兩組患者臨床基本資料比較 例

1．2 標本收集 ①患者空腹，使用凝血管采集肘部靜脈血，2 h內分離血清。采血后輕輕倒轉采血管4～5次，直立置于室溫待血液完全凝固，1 000 r/min離心10 min，分離血清，轉移至專用凍存管中，于－80℃冰箱中保存。②將手術取得的宮頸組織處理干凈，迅速放入液氮中，于－80℃冰箱中保存。

1．3 m iR-26a的檢測 miR-26a、小核 RNA6(U6)特異性引物購于上海生工生物工程有限公司。Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司。實時熒光定量PCR試劑盒購自北京鼎國公司。取凍存的宮頸組織100 mg于液氮中研磨，或取凍存的血清標本100 μL，放入1．5 mL EP管中，Trizol一步法提取 RNA，異丙醇法濃縮RNA，用分光光度計測定總RNA純度，甲醛變性凝膠電泳檢測總RNA質量。采用實時熒光定量PCR試劑盒進行擴增。反應條件:95℃預變性30 s;95℃ 5 s;60℃ 30 s，40個循環。采用2－ΔΔCt法分析 miR-26a 表達水平。

1．4 統計學處理 采用SPSS 21．0對數據進行統計學分析。兩組年齡構成、病史等的比較采用χ2檢驗或精確概率法，血清和宮頸組織中miR-26a表達水平的比較采用兩獨立樣本的t檢驗。采用Pearson相關系數評價病例組血清和癌組織中miR-26a表達水平的相關性。繪制依據高危型HPV陽性者血清miR-26a表達水平診斷宮頸癌的ROC曲線，分析預測價值。檢驗水準α=0．05。

2 結果

2．1 兩組血清和宮頸組織中m iR-26a表達水平的比較 病例組血清和宮頸組織中miR-26a表達水平均低于對照組，見表2。Pearson相關分析結果顯示，病例組血清和宮頸組織中miR-26a表達水平呈正相關(rP=0．535，P ＜0．001)。

表2 兩組血清和宮頸組織標本中m iR-26a的表達水平

2．2 血清m iR-26a表達水平對高危型HPV陽性患者宮頸癌的鑒別診斷價值 血清miR-26a表達水平診斷高危型HPV陽性者發生宮頸癌的ROC見圖1。曲線下面積為 0．887(95%CI=0．808 ～0．941);診斷界點取3．94時，敏感度為78．0%，特異度為88．0% 。

圖1 血清m iR-26a表達水平預測高危HPV陽性者發生宮頸癌的ROC

3 討論

HPV是一種環狀的雙鏈DNA病毒，核心是由7 800～7 900個堿基對以共價鍵形式組成的含有遺傳信息的閉合環狀雙鏈DNA，外圍由72個殼粒包被，形成對稱的20面體［3，5］。HPV 根據其生物學特征和致癌潛能，分為高危型和低危型。高危型HPV的E6和E7基因編碼的原癌蛋白是引起宮頸癌發生的重要因子［3，5］。E6 蛋白能夠通過 E6-AP 特異性結合P53蛋白，導致P53蛋白快速降解，促使細胞周期失控。E7蛋白和pRb具有高度親和性，可以促使E2F和pRb復合物解離，使G1期進入S期所需的基因(如DNA聚合酶α、c-myc)得以轉錄，從而促使細胞周期失控且發生永生化［2-3，5-6］。

miR-26a是新發現的一種miRNA，其抑癌基因作用在胃癌、肺腺癌等癌癥中已經得到證實［7-8］。已有研究［9］證實miR-26a/Bad/Bax生物軸能夠誘導多形性成膠質細胞瘤對替莫唑胺耐藥，該效應通過缺氧介導的線粒體凋亡實現。有研究［7，10］表明同源框蛋白HOXC9可促進胃癌細胞的轉移和干細胞樣表型表達，而這些效應可被miR-26a逆轉。小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)是一種競爭性內源RNA，它能夠與miR-26a-5p結合，從而影響E2F7蛋白的表達，參與細胞的生物學調控。也有研究［8，11］表明miR-26a/E2F7能夠作為一條反饋環路，參與細胞的生物信息學調控。以上研究結果提示miR-26a可能通過影響E7蛋白的表達，調控E2F家族的表達，參與宮頸癌的發生發展。

本研究結果顯示，高危型HPV陽性宮頸癌患者癌組織和血清標本中miR-26a的表達水平低于高危型HPV陽性的良性病變者，宮頸癌患者血清和癌組織中miR-26a的表達水平呈正相關;進一步的ROC分析結果顯示，血清miR-26a表達水平對高危型HPV陽性的宮頸癌與良性病變具有一定的鑒別診斷價值，曲線下面積為0．887(95%CI=0．808 ～0．941)，診斷界點取3．94時，敏感度可達78．0%，特異度達88．0%。因此，我們認為血清miR-26a水平對高危型HPV陽性患者宮頸癌的發生具有一定預測價值。