人乳頭瘤病毒檢測方法及其應用進展

彭彩姣　熊正愛

[摘要] 宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，早發(fā)現(xiàn)、早治療是預防宮頸癌的關鍵。除細胞學檢查外，HPV檢測也是宮頸癌篩查的重要方法。最初的HPV檢測方法主要是基于形態(tài)學，如細胞學、組織學、免疫組化及電鏡等，但因敏感度和特異度均不理想，操作較繁瑣，臨床使用較少。目前應用于臨床的HPV檢測方法為基于現(xiàn)代分子生物學的核酸技術，靈敏度及特異度均較高。該文就國內(nèi)、外普遍應用的HPV檢測方法及其應用進展作一簡述。

[關鍵詞] 宮頸癌;宮頸上皮內(nèi)瘤變;人乳頭瘤病毒;檢測

[中圖分類號] R737? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-0742（2019）07（a）-0196-03

Progress in Detection of Human Papillomavirus and Its Application

PENG Cai-jiao， XIONG Zheng-ai

The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing， 400010 China

[Abstract] Cervical cancer is a common malignant tumor in women. Early detection and early treatment are the key to prevent cervical cancer. In addition to cytology， HPV testing is also an important method for cervical cancer screening. The original HPV detection method is mainly based on morphology， such as cytology， histology， immunohistochemistry and electron microscopy， but the sensitivity and specificity are not ideal， the operation is cumbersome， and the clinical applications are fewer. The current HPV detection method applied to the clinic is based on modern molecular biology nucleic acid technology， and the sensitivity and specificity are high. This paper gives a brief introduction to the domestic and foreign HPV detection methods and their application progress.

[Key words] Cervical cancer; Cervical intraepithelial neoplasia; Human papillomavirus; Detection

目前宮頸癌仍嚴重威脅全球女性的生命健康，仍是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，世界范圍內(nèi)宮頸癌居女性惡性腫瘤第4[2]，每年約有50萬的新發(fā)病例，每年死亡病例超過26萬，均主要發(fā)生于社會經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)[3]。隨著宮頸癌細胞學檢查聯(lián)合HPV檢測的篩查模式的推廣及逐漸普及，全球?qū)m頸癌的死亡率和發(fā)生率下降明顯，但在發(fā)展中國家尤其是中低收入國家有上升趨勢，數(shù)據(jù)顯示我國則有逐漸上升[4]。

長期以來宮頸癌篩查以細胞學檢查為主，隨著HPV感染和宮頸腫瘤之間的直接因果關系被證實[5-7]，HPV檢測逐漸成為宮頸癌的重要部分。HPV檢測雖特異性較低，但高敏感性、高陰性預測值等特點更突出，近期研究提出，聯(lián)合篩查在預防宮頸癌發(fā)揮的重大意義可能在于HPV檢測[8]，HPV檢測在預防宮頸癌方面可提供更多的保護[9]。該文將對以下HPV檢測方法及其應用進展作一簡述。

1? HPV DNA檢測

1.1? 雜交捕獲（Hybrid Capture，HC）技術

HC-II技術1999年成為美國FDA認證的第一個用于宮頸癌篩查的HPV檢測方法，基因雜交基礎上利用化學發(fā)光對抗體捕獲的信號放大原理，對高危型HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型進行檢測，并可進行病毒載量半定量檢測，因有統(tǒng)一的臨床判定標準，檢測結(jié)果客觀性較高，且重復性好，采用HPV全長堿基對設計避免了因靈敏度過高導致的假陽性，無需基因擴增有效避免環(huán)境因素造成的假陰性。研究顯示HC-II法對CIN2及以上病變的敏感度及特異度分別為97.1%和85.6%[10]，因此HC-II法至今被作為HPV檢測的金標準，但該方法不能具體分型、缺乏內(nèi)質(zhì)控，且成本高，與低危型HPV型也存在交叉反應[10-11]。

careHPV檢測是一種宮頸癌快速篩查技術，2018年8月獲世界衛(wèi)生組織資格認證。careHPV檢測同樣基于HC-II的原理，但除能檢測常見13種高危型HPV外，還能檢測HPV 66型，且操作簡易、價格低廉、檢測用時短，因此，該方法被認為非常適用于衛(wèi)生資源匱乏地區(qū)等發(fā)展中國家，包括中國農(nóng)村。臨床結(jié)果顯示，CcareHPV對CIN2及以上病變的靈敏度為90%，特異度為84.2%，與HC-II檢測接近[12]。

1.2? Invader 酶切信號放大法

該方法采用Invader專利技術，通過分子雜交和化學信號放大，直接檢測特定HPV DNA序列。2009年美國FDA批準使用的Cervista HPV檢測則基于該方法，對HPV DNA的L1、E6/E7區(qū)進行檢測，這可避免僅檢測L1區(qū)所造成的假陰性，且與多數(shù)低危型HPV無交叉反應，降低了假陽性率[13]，也能進行內(nèi)質(zhì)控，其有兩種試劑盒：Cervista HR HPV和Cervista HPV16/18，前者能檢測14種高危型HPV，并將其分為A5/6、A7、A9 3組，但認為分組檢測的臨床意義尚不能明確[14]，后者可對HPV16/18分型。Belinson等在中國廣東省納入1萬女性的研究中Cervista HR HPV對CIN3及以上病變的靈敏度為95.1%（95%，90%～98%），與HC-II法無明顯統(tǒng)計學差異，但特異度顯著高于HC-II法（P<0.05）[15]。

1.3? 聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術

這類方法多樣，包括常規(guī)PCR技術、實時熒光定量PCR技術、PCR-酶聯(lián)免疫吸附測定檢測技術、PCR結(jié)合返向雜交技術等。2011年獲FDA批準用于宮頸癌篩查的Cobas 4800 HPV檢測則以實時熒光定量PCR技術為基礎，可檢測14種高危型HPV，并提供HPV16、18同步基因分型，但對余12種不能具體分型，敏感性和特異性均較高，且不存在與低危型HPV的交叉反應，但因敏感性過高，易導致假陽性率的增加。Mark等[16]的研究顯示，Cobas 4800 HPV檢測在靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值方面與HC-II法無明顯差異，且兩者一致性高，在CIN2以下和CIN2及以上的病變中的一致性分別為90.6%（95%，89.1%～92%）和96.2%（95%，89.5%～98.7%）。Lapierre等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Cobas 4800 HPV檢測的重復性較好，多次檢測的一致率較高，降低了操作成本，同時能對是否行陰道鏡下活檢提供有效幫助信息。基于ATHENA的研究結(jié)果[18]，2014年Cobas 4800 HPV檢測成為美國FDA唯一批準用于25歲女性宮頸癌一線初篩的HPV 檢測方法。隨著國內(nèi)外學者深入探索，發(fā)現(xiàn)HPV自取樣技術的參與率高于細胞學篩查，群眾可接受度更高[19]，HPV自取樣或許可作為宮頸癌初篩手段[20]，且應用基于PCR 的HPV檢測方法進行自取樣標本可獲得與醫(yī)生取材一樣的敏感性[21-22]，因此有學者認為Cobas HPV檢測技術也可用于HPV自取樣。

目前在中國廣泛使用的HPV基因分型檢測結(jié)合PCR技術、導流雜交及基因芯片技術為一體，可同時檢測21種HPV基因型別，包括13種常見的高危型HPV、5種低危型HPV（6、 11、42、 43、 44、81型）和中國人常見基因型（HPV53、66、81型），并具體分型，判斷多重感染[23]。

今年美國FDA批準的BD Onclarity HPV 檢測系統(tǒng)，同樣基于PCR技術。大多數(shù)HPV檢測方法針對的是HPV基因組L1區(qū)，而該方法針對E6/E7 DNA 癌基因，其中樣品處理、核酸提取、即時PCR擴增、檢測以及結(jié)果報告均為自動化處理，同樣可檢測14種高危型HPV，但其報告為：6種高危型HPV（16、18、31、45、51和52型）為獨立結(jié)果和其余8種高危型HPV另分為三個獨立報告：（33、58型）、（35、39、68型）和（56、59、66型），可降低人為干預，大幅度提高實驗室的工作效率。

2? HPV mRNA檢測

該方法利用轉(zhuǎn)錄介導等溫擴張技術，提取HPV E6/E7mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄擴增，分別對16型、18/45型和其他11種高危型HPV進行檢測。研究數(shù)據(jù)顯示該方法既具備HPV DNA的敏感性，又有與細胞學檢查相似的特異性[24]，能較好平衡HPV檢測的敏感性和特異性，同時可降低傳統(tǒng)HPV DNA檢測對于一過性HPV感染的檢出率。E6/E7為HPV的致癌基因，在大量HPV持續(xù)被轉(zhuǎn)錄為E6/E7 mRNA ，表達大量癌蛋白時，可增加細胞惡變的風險[25-26]，因此較HPV DNA檢測，HPV mRNA檢測或許更能發(fā)現(xiàn)具有臨床意義的HPV感染[27]，真正識別高風險的宮頸癌前病變?nèi)巳篬28]。Aptima HPV檢測即為一種HPV mRNA檢測，包括Aptima HPV和Aptima HPV16/18/45 Genotype，后者可對前者陽性結(jié)果進一步分型，兩者均在2011年獲得美國FDA批準。但該方法同樣缺乏內(nèi)質(zhì)控，不能具體分型，也可能與低危型HPV有交叉感染。

3? 結(jié)語

宮頸癌篩查的目的在于盡可能識別出真正的癌前病變，避免對HPV一過性感染的過度檢查及過渡治療。HPV檢測作為作為宮頸癌的重要篩查手段，基于HPV檢測的優(yōu)勢，在發(fā)展中國家，尤其是經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)可能有更高的應用前景，若合理利用，將對全球的宮頸癌防控產(chǎn)生重大意義。

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