阿侖膦酸鈉干預膝關節炎大鼠Wnt通路及Ⅱ型膠原蛋白的實驗機制研究

鄧斌　王錫奕　許冬青　康書鵬　張廣波　莊鑫泓　王曉躍　許鎮文

【摘要】 目的：觀察阿侖膦酸鈉（ALN）對IL-1β體外誘導培養的大鼠膝關節軟骨細胞的影響，探討ALN治療膝關節炎的機制。方法：取4周齡SPF級SD大鼠15只關節軟骨細胞原代培養并傳至第3代，將第3代軟骨細胞平均分為3組：空白對照組（SD CON）軟骨細胞用常規DMEM完全培養液培養5 d;IL-1β誘導組（SD IL-1β）軟骨細胞用10 ng/mL重組人IL-1β培養2 d后更換為常規DMEM完全培養液培養3 d;

IL-1β+ALN組（SD IL-1β+ALN）軟骨細胞用10 ng/mL重組人IL-1β培養2 d后更換為濃度為

1×10-6mol/L的ALN培養3 d。培養后取細胞進行比較觀察，檢測各組中Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16的變化。結果：Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a和Wnt16在軟骨細胞中均有表達，經ALN處理后軟骨細胞中Ⅱ型膠原蛋白增加。Wnt3a在空白對照組和IL-1β誘導組表達比較，差異無統計學意義（P>0.05），在IL-1β+ALN組中表達量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;Wnt5a在IL-1β誘導組中的表達量明顯高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;ALN處理后，表達量降低，但仍高于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;Wnt16在IL-1β誘導組中表達量明顯低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）;ALN處理后表達量升高，但仍低于空白對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論：ALN可能通過Wnt信號通路提高Wnt3a、Wnt16的表達與降低Wnt5a的表達，間接影響RANKL/RANK/OPG信號系統，并影響下游MMP-13、β-catenin及Collagen Ⅱ蛋白的表達來共同調節破骨細胞和成骨細胞的動態平衡，從而保護軟骨和軟骨下骨。

【關鍵詞】 阿侖膦酸鈉; Wnt信號通路; Ⅱ型膠原蛋白; 骨關節炎; 大鼠

Research of Mechanism on Affect of Alendronate Sodium on Wnt Signaling Pathway and Collagen Ⅱ in Knee Osteoarthritis Rats/DENG Bin，WANG Xiyi，XU Dongqing，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：0-030

【Abstract】 Objective：To research the effect of Alendronate Sodium（ALN）on chondrocytes induced by IL-1β in vitro in knee osteoarthritis rats and to explore the mechanism of ALN in the treatment of knee osteoarthritis.Method：Fifteen articular chondrocytes of 4-week-old SPF-grade SD rats were cultured and passaged to the third passage.The third generation chondrocytes were divided into three groups：blank control group（SD CON），chondrocytes were cultured in DMEM complete medium for 5 d.IL-1β induction group（SD IL-1β），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with normal DMEM complete culture medium for 3 d.IL-1β+ALN group（SD IL-1β+ALN），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with ALN with a concentration of 1×10-6 mol/L for 3 d.The changes of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 in each group were detected.Result：The expression of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 were found in chondrocytes，the increasing expression of Collagen Ⅱ after ALN treatment.There was no significant difference in the expression of Wnt3a between the blank control group and IL-1β induction group（P>0.05）.The expression of Wnt3a in IL-1β+ALN group was significantly higher（P<0.05）.The expression of Wnt5a in IL-1βinduction group was significantly higher than that in blank control group（P<0.05），after ALN treatment it decreased，but it was still higher than that in the blank control group（P<0.05）.And the expression level of Wnt16 in IL-1βinduction group was significantly lower than that in the blank control group（P<0.05），after ALN treatment it increased，but it was still lower than that of the blank control group（P<0.05）.Conclusion：By Wnt signaling pathway Alendronate Sodium can increase the expression of Wnt3a，Wnt-16 and decrease that of Wnt5a and indirectly affect the RANKL/RANK/OPG signaling pathway and the downstream factor，for example MMP-13，β-catenin and Collagen Ⅱ proteins，co-regulate the dynamic balance of osteoclasts and osteoblasts，protect cartilage and subchondral bone.

【Key words】 Alendronate Sodium; Wnt signaling pathway; Collagen Ⅱ; Osteoarthritis; Rat

First-authors address：Traditional Chinese Medicine Hospital in Puning City，Puning 515300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.007

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常見而多發的慢性關節疾病，女性發病率高于男性[1]，這可能與女性內分泌的變化特點和骨質疏松有關。目前我國膝關節骨關節炎（KOA）的發病率隨年齡增長逐步上升，王斌等[2]對中國人KOA流行病學特征進行系統評價，結果發現中國KOA的患病率約為18%。近年來國內外已有不少學者基于臨床水平研究了治療OA的藥物，但OA發病原因和機制目前尚未完全闡明。文獻[3]報道用阿侖膦酸鈉（ALN）治療OA，可明顯改善膝關節炎的病理病變，取得了較好的效果，引起了很多學者極大的興趣。本研究通過對IL-1β體外誘導培養的大鼠膝關節軟骨細胞進行ALN干預，通過免疫細胞化學和實時PCR檢測軟骨細胞中Ⅱ型膠原（Collagen Ⅱ）、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16等表達情況，觀察ALN對大鼠膝關節軟骨細胞的影響，探討ALN治療膝關節炎的作用機制，為臨床應用ALN治療OA提供理論依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡SPF級SD大鼠15只，雌雄不限，體重100～150 g，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。

1.2 主要實驗儀器 實時熒光定量PCR儀（ABI，7500），超微量核酸分析儀（Nano-200），PCR儀（北京東林昌盛科技有限公司，DL9700），倒置顯微鏡（OLYMPUS，CKX41）。

1.3 主要實驗試劑 ALN（北京萬生藥業公司）;Collagen Ⅱ、多克隆抗體，Trizol（Invitrogen），甲苯胺藍染色液（G3663），Wnt3a（abcam），Wnt5a（abcam），Wnt16（Santa），重組人IL-1β（abcam），DAB顯色試劑盒（AURAGENE）。

1.4 實驗分組 將第3代軟骨細胞分為3組，空白對照組（SD CON）：軟骨細胞用常規DMEM完全培養液培養5 d;IL-1β誘導組（SD IL-1β）：軟骨細胞以10 ng/mL、重組人IL-1β培養2 d后更換為常規DMEM完全培養液培養3 d;IL-1β+ALN組（SD IL-1β+ALN）：IL-1β誘導后加ALN培養軟骨細胞以10 ng/mL重組人IL-1β培養2 d后更換為濃度為1×10-6 mol/L的ALN培養3 d。培養后取細胞進行以下觀察。

1.5 實驗方法

1.5.1 大鼠膝關節軟骨細胞原代培養 取4周齡SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即采用75%乙醇浸泡，在無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離大腿腿骨，盡可能去除筋膜、肌肉和結締組織;從關節處分離出軟骨組織，剪成小于1 mm3的組織塊，用含有雙抗的PBS沖洗2次，加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶，置入37 ℃的恒溫搖床中，震蕩消化

30 min;4 ℃靜置5 min，棄上清，加入0.2%膠原酶Ⅱ，置于37 ℃的恒溫搖床中，震蕩消化30～60 min;加入培養基終止消化，反復吹打后通過200目濾網。收集濾液，1 200 r/min離心8 min，棄上清，用培養基重新懸浮細胞，置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每3天更換培養液至第5天更換培養液，軟骨細胞原代培養中，約24 h出現貼壁生長，細胞三角形或多角形，生長緩慢，培養3～5 d進入快速增殖期。

1.5.2 甲苯胺藍染色 取處于對數生長期的大鼠關節軟骨細胞，消化后以2×104個細胞/孔接種于鋪有爬片的24孔板中，每孔最終培養基量為500 ?L，

培養24 h后吸去孔內培養基，用PBS清洗干凈。每孔加入500 ?L多聚甲醛，固定15 min。吸去孔內多聚甲醛，用PBS清洗2次。每孔加入0.1%甲苯胺藍染色液500 ?L，染色30 min后鏡檢拍照。

1.5.3 免疫組化 固定好的細胞爬片空氣干燥

5 min，PBS沖洗后，1%Triton X-100（DPBS配制）孵育10 min，PBS沖洗，滴加適當稀釋的一抗，空白對照組滴加等量PBS，37 ℃溫箱放置1.5 h，孵育二抗，將載玻片從冰箱中取出，沖洗后，滴加50～100 μL二抗，37 ℃溫箱孵育30 min將片子從溫箱中取出，沖洗后滴加預制好的顯色劑DAB工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應時間，將顯色后的片子蒸餾水洗滌，浸泡于蘇木素中復染1～3 min，蒸餾水沖洗，95%酒精脫水

3 min，2次，中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

1.5.4 qPCR染料法檢測 采用Trizol法提取各組軟骨細胞總RNA，RNA定量后逆轉錄合成第1鏈cDNA，用實時熒光定量PCR儀進行PCR反應。引物序列，見表1。PCR反應體系：上下游引物（10 μmol/L）0.5 ?L，cDNA 1.5 μL，ddH2O

10 μL，SYBR Green I 2×5 μL。PCR反應條件：

95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s

40個循環檢測樣本Ct值。以GAPDH為對照內參基因，并行統計學分析。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。