甲狀腺細針穿刺吸取細胞學標本中miR-221與miR-222對良惡性甲狀腺結節的診斷價值研究

閆永鑫，徐寧，王國鳳*

甲狀腺結節的發病率逐年升高，總發病率為19%～46%，其中惡性結節占5.0%～15.0%，超聲引導下甲狀腺細針穿刺活檢（US-FNAB）聯合病理學檢查是篩查和早期診斷甲狀腺癌的有效方法，但仍存在一部分無法確診的病例［1]。而這部分無法確診的甲狀腺結節患者術后多為良性，惡性率僅占1.7%～11.3%［2]。因此，為避免增加此類患者的手術風險及經濟負擔，積極尋找可靠、可行的檢測指標來鑒別甲狀腺結節的良惡性以及評估其惡性程度是目前甲狀腺結節研究中迫切需要解決的問題。為提高甲狀腺術前診斷的準確性，近年來許多研究聚焦于早期診斷預警指標，其中微小RNA（miRNAs）是研究的熱點之一［3-4]。已有研究發現，miRNAs表達水平有助于提高術前診斷率及評估腫瘤惡性程度等［5]。可將腫瘤組織中異常表達的miRNAs作為甲狀腺乳頭狀癌的新型腫瘤標志物，但獲取組織標本具有較大創傷性，同時術后常規標本檢測miRNAs常具有滯后性［6]。因此，國內外學者開始關注外周血和細針穿刺吸取細胞學（FNAC）檢查中miRNAs在甲狀腺結節診斷中的價值［7-9]。為進一步探討miRNAs作為早期診斷甲狀腺癌生物學標志物的可行性，本研究觀察甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222表達水平，并分析其對甲狀腺結節的診斷價值，以期明確甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222表達水平的分子學價值。

國內外文獻研究現狀：

已有研究發現，微小RNA（miRNAs）表達水平有助于提高術前診斷率及評估腫瘤惡性程度等，但獲取組織標本具有較大創傷性，而術后常規標本檢測miRNAs則常具有滯后性。因此，國內外學者開始關注外周血和細針穿刺miRNAs在甲狀腺結節診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2017年12月就診于南京醫科大學康達學院第一附屬醫院符合研究標準的甲狀腺結節患者60例。排除標準：冠心病、高血壓、糖尿病、腎病、自身免疫疾病、凝血功能障礙者?；颊呔浖谞钕貴NAC檢查，并依據甲狀腺FNAB的細胞學分類（貝塞斯達系統）［10]得出惡性病變17例，良性病變34例，可疑惡性、未診斷病變5例，2例濾泡性病變，2例濾泡性腫瘤。本研究經連云港市第一人民醫院倫理委員會批準，患者均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤最大直徑、病灶數量、包膜侵犯、淋巴結轉移、TNM分期情況。

1.2.2 甲狀腺FNAC檢查 患者均在超聲引導下行FNAB檢查，對于多發結節，選擇超聲惡性征象最多的結節為穿刺結節，采用10 ml細針穿刺負壓吸引器連接7號針頭進行抽吸，并將抽吸物注于載玻片上進行檢測。注射器內剩余的穿刺物用0.9%氯化鈉溶液反復洗滌后置于離心管中，1600 r/min離心30 min（離心半徑8 cm）后棄上清液，將700 μl Qizol加入細胞中混勻，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

FNAB檢查結果參照美國國家癌癥研究提出的貝塞斯達系統進行診斷［10]。

1.2.3 PCR法檢測miR-221、miR-221表達水平 將冰箱凍存備用的細胞液取出，參照陳曉敏等［9]的具體操作方法，采用PCR法檢測miR-221、miR-221表達水平。采用2-ΔΔCt法對數據進行統計分析。

1.2.4 金標準 以甲狀腺術后病理檢查結果為診斷良、惡性甲狀腺結節的金標準。

1.3 統計學方法 采用SPSS 24.0統計學軟件進行分析數據分析。所有統計學指標經過正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222診斷惡性甲狀腺結節的受試者工作特征曲線（ROC曲線），并計算ROC曲線下面積（AUC）、靈敏度、特異度、約登指數。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者甲狀腺術后病理結果 60例患者經甲狀腺術后病理檢查示，良性結節51例，惡性結節9例。

2.2 良性結節與惡性結節患者FANC檢查中miR-221、miR-222表達水平比較 惡性結節患者FANC檢查中miR-221、miR-222表達水平高于良性結節患者，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 良性結節與惡性結節患者甲狀腺FANC檢查中miR-221、miR-222表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

表1 良性結節與惡性結節患者甲狀腺FANC檢查中miR-221、miR-222表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of the expression levels of miR-221 and miR-222 in FANC with benign and malignant thyriod nodules

分類 例數 miR-221 miR-222惡性結節 483.33±0.933.42±0.84良性結節 92.54±0.432.63±0.05 t值 5.906.41 P 值 ＜0.01 ＜0.01

2.3 甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222對甲狀腺惡性結節的診斷價值 甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221診斷甲狀腺惡性結節的AUC為0.774（0.691，0.858），其最佳截斷值為2.77，靈敏度為80.0%，特異度為60.0%，約登指數為0.400。甲狀腺FNAC檢查標本中miR-222診斷甲狀腺惡性結節的AUC為0.759（0.672，0.845），其最佳截斷值為2.73，靈敏度為76.7%，特異度為66.7%，約登指數為0.44（見圖1）。

圖1 甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222診斷惡性甲狀腺結節的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-221 and miR-222 in thyroid nodule FNAC examination specimens for diagnosis of malignant thyroid nodules

2.4 甲狀腺FNAC檢查結果聯合甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結節的符合率 術后病理檢查結果良性51例、惡性9例。甲狀腺FNAC檢查結果聯合甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結節的符合率均在70.0%以上，其中甲狀腺FNAC檢查結果聯合甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222診斷甲狀腺結節與術后病理檢查結果的符合率為80.0%（見表2）。

表2 甲狀腺FNAC檢查結果、甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221及miR-222單獨與聯合診斷甲狀腺結節的符合率情況Table 2 Independent or combined diagnostic coincidence rate of thyriod nodules FNAC result，miR-221 and miR-222 in thyriod nodules FNAC specimens for thyroid nodules

2.5 不同患者miR-221、miR-222表達水平比較 不同性別、年齡、腫瘤最大徑、病灶數量、包膜侵犯情況、淋巴結轉移情況、TNM分期患者miR-221、miR-222表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表3）。

3 討論

研究發現miRNA與人類多種腫瘤的發生、發展密切相關，且在腫瘤的基因診斷、靶向治療等方面起到了重要作用［3-5]。miR-221與miR-222是成簇的microRNAs，基因位于X染色體P11.3區約1 kb的區域內，呈同步表達，其序列在各物種間高度保守。miR-221和miR-222可以抑制細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑p27kipl的表達，促進細胞從G1期向S期的轉變，進而抑制腫瘤細胞的增殖。miR-221可通過調節HOXB5基因的表達抑制細胞凋亡，高表達的miR-221和miR-222作用于關鍵靶基因成為甲狀腺癌癌變的關鍵因素［11-18]。研究證明，miR-221和miR-222在PTC、濾泡性乳頭狀癌、濾泡性腫瘤、甲狀腺濾泡性腺瘤中的表達升高［14]。且值得注意的是，miR-221與miR-222是在PTC中高表達最恒定的miRNA，在未分化甲狀腺癌（ATC）中也明顯上調，而在濾泡性腺瘤與增生性結節中卻沒有發現上調［15]。因此，miR-221、miR-222在甲狀腺癌組織中具有特異性表達，組織標本中的miRNAs異常表達可用于對甲狀腺結節的早期篩查和診斷。

表3 不同患者miR-221、miR-222表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

表3 不同患者miR-221、miR-222表達水平比較（±s）Table 3 Comparison of the levels of miR-221，miR-222in different patients

項目 例數 miR-221 t值 P值 miR-222 t值 P值性別男 273.16±1.241.19 ＞0.053.05±0.861.04 ＞0.05女 332.98±2.032.78±0.75年齡（歲）＜45293.89±1.021.10 ＞0.053.02±0.711.02 ＞0.05≥45312.87±1.892.56±0.79腫瘤最大直徑（cm）＜1 283.02±1.121.46 ＞0.051.98±0.76-1.47 ＞0.05≥1323.01±0.983.40±1.86病灶數量單發 322.98±1.23 -0.93 ＞0.053.41±1.280.94 ＞0.05多發 283.12±1.082.11±0.66包膜侵犯否 343.67±2.320.42 ＞0.052.18±0.78-0.38 ＞0.05是 262.79±0.763.53±1.32淋巴接轉移否 333.12±2.130.59 ＞0.052.13±0.46-0.29 ＞0.05是 272.65±1.563.62±2.12 TNM分期Ⅰ+Ⅱ 353.79±1.031.93 ＞0.052.45±0.62-0.11 ＞0.05Ⅲ+Ⅳ 252.74±2.023.62±1.48

雖然腫瘤組織中的miRNAs可以作為一種新的、有前景的腫瘤標志物，但是，為了獲得腫瘤組織的miRNAs，進行有創手術顯然不適用于廣泛的臨床應用，而甲狀腺FNAC可以改善這種情況，其微創獲取標本，或許可以為早期診斷提供幫助。已有研究表明，甲狀腺FNAC檢查標本中miRNA或許在甲狀腺腫瘤診斷中具有潛在的應用價值［19-21]。為此，本研究通過甲狀腺FNAC檢查獲取標本，采用PCR法檢測標本中miR-221、miR-222表達水平，并探討其是否可作為診斷甲狀腺癌的分子生物標志物。本研究結果顯示，惡性甲狀腺結節患者甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222表達水平明顯高于良性結節患者，但繪制ROC發現，二者分別診斷惡性甲狀腺結節的靈敏度和特異度并未超過95%，提示單獨的miR-221、miR-222尚不能用于作為診斷惡性甲狀腺結節的生物學標志物。進一步分析發現，甲狀腺FNAC檢查聯合miR-221、miR-222可以提高對甲狀腺結節診斷的符合率。但本研究仍存在樣本量有限等不足，因此結果的實際應用價值有待于更大樣本的多中心研究進一步證實。

綜上所述，惡性甲狀腺患者甲狀腺FNAC檢查標本中miR-221、miR-222表達水平明顯升高，其目前不適于單獨鑒別良惡性甲狀腺結節，但聯合甲狀腺FNAC檢查結果可以提高對良惡性甲狀腺結節的診斷效能。