白酒酒醅中兩種多肽的鑒定及其抗氧化和降血壓功能評價

孫金沅，姜云松，劉國英，李賀賀，吳繼紅，孫嘯濤，孫寶國*

1(北京工商大學，北京食品風味化學重點實驗室，北京，100048) 2(北京工商大學，食品質量與安全北京重點實驗室，北京，100048) 3(安徽古井貢酒股份有限公司，安徽 亳州，236800)

酒醅是白酒釀造過程中，高粱、小麥、糯米、玉米、大麥等原料蒸煮后與糖化發酵劑混合，并在微生物的作用下發酵后，預備蒸餾取酒的原料[1]。由于制作酒醅的原料中存在較高的蛋白含量，其中一定含量的蛋白能夠在微生物的作用下分解為多肽。目前，對酒醅中功能性多肽的分析研究較少，僅有課題組前期研究中在芝麻香型白酒酒醅中分離鑒定出了多肽Val-Asn-Pro(VNP)和Tyr-Gly-Asp(YGD)，并進行了初步的生物活性研究[2]。

生物活性肽的來源廣泛，可以直接從動植物蛋白中獲取，如魚肉[3]、火腿[4]、稻米[5]和麥芽[6]等。目前，多肽常用的提取分離方法有酶解法[7]、堿提酸沉淀法[8]、堿酶兩步法[9]、超聲輔助酶解法[10]等復合法以及微生物發酵法[11]，常用的分離純化方法有大孔吸附樹脂純化[12]、凝膠層析[13]、制備型液相色譜和蛋白純化儀[14]，而多肽結構鑒定通常采用氨基酸分析儀[15]、高效液相-四級桿-飛行時間質譜(high performance liquid chromatography- quadruple-time of fly -mass spectrum/mass spectrum, HPLC-Q-TOF-MS/MS)[16]、聚丙烯酰胺凝膠電泳[17]、基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜[18]等方法。

抗氧化功能是多肽具有的主要功能之一[19]。2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸法(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl, DPPH)、還原力法、氧化自由基吸收能力法(oxygen radical absorbance capacity, ORAC)和亞鐵螯合力測定法[20]等是較為常用的抗氧化能力測定方法。隨著對多肽研究的不斷深入[21-22]，血管緊張素轉換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)抑制活性同樣也是部分多肽所具有的功能之一， ACE抑制肽可以同時阻礙ACE催化水解血管緊張素I以及使緩激肽失活這2種生化反應過程，來達到降血壓的作用[22]。目前，吳繼紅等[23]已從白酒中鑒定出具有ACE抑制活性的多肽脯氨酸-組氨酸-脯氨酸(PHP)，其半抑制濃度(ICSO)為446 mmol/L。

多肽沸點較高，但是由于白酒采用獨特的固態甑桶蒸餾方式，蒸餾過程中甑內酒醅中的酒精及其他微量成分經過多次汽化-冷凝-汽化的過程達到多組分濃縮和提取的效果，也會有少量難揮發的組分進入酒中[24]，例如多肽以及一些高沸點的酸類等，但是含量非常少。本研究將在前期對芝麻香型白酒酒醅研究[2]的基礎上，以濃香型白酒古井貢酒酒醅為研究對象進行未知多肽的提取、純化和鑒定，并對其體外抗氧化活性和ACE抑制活性進行測定，旨在進一步研究白酒酒醅中對人體健康有益的物質，為后期通過改進蒸餾工藝增加其在白酒中的含量，為提高白酒的健康屬性提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒酒醅，由安徽古井貢酒股份有限公司提供；XAD-16非離子型大孔樹脂、NaOH(純度≥ 96%)，麥克林上海有限公司；Sephadex G-15 凝膠，北京索萊寶科技有限公司；甲酸(HPLC級，純度≥ 99%)、乙腈(HPLC級，純度≥ 99.9%)，北京迪馬科技有限公司；馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(hyaluronyl-histidyl-leucine，HHL)、馬尿酸(hippuric acid，HA),(純度≥99.0%)，上海源葉生物科技有限公司；血管緊張素轉換酶(1UN)、ABTS試劑盒、DPPH試劑盒、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid, Trolox)，美國Sigma-Aldrich試劑公司;Val-Pro-Asp(VPD)、Leu-Gly-Ala(KGP)標準品(純度≥ 98%)，上海吉爾生化有限公司；H2SO4(純度≥ 98%)，國藥集團化學試劑有限公司；FeCl2(純度>98%)，北京伊諾凱科技有限公司；FeCl3(純度≥98%)、鐵氰化鉀(純度≥99.5%)、過硫酸鉀(純度≥ 98%)、苯酚，西隴科學股份有限公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis-2-methyl-propanimidamide, dihydrochloride，AAPH) (純度≥ 98%)，比利時Acros試劑公司；EDTA Na2(純度≥ 99%)，北京博奧拓達科技有限公司；pH值為7.4和6.6的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline， PBS)，上海碧云天生物技術有限公司；啡咯嗪(ferrozine)，北京拜爾迪生物技術有限公司；三氯乙酸，阿法埃莎(中國)化學有限公司。

1.2 儀器與設備

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；KH-500DE型數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Pellicon超濾裝置，德國Merck Millipore公司；1 kDa超濾膜，EMD Millipore有限公司；MB99-2自動液相色譜分離層析儀、HD-3紫外檢測器，上海青浦滬西儀器廠；Agilent1 260液相色譜、Agilent 1200制備型液相、Agilent1 290高效液相-四級桿-6 530飛行時間質譜，美國Agilent公司；Xbridge Peptide BEH C18反相色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Xbridge Peptide BEH C18反相色譜柱(150 mm×10 mm，5 μm)，愛爾蘭Waters公司；FD-1B-80型冷凍干燥機，南京普森儀器；Molecule M2酶標儀，美國分子儀器有限公司。

1.3 酒醅中肽的提取

準確稱取-20 ℃冷凍狀態保存的酒醅400 g，在50 ℃下烘干至恒重，粉碎后與色譜純正己烷以1∶5(g∶mL)的比例混合，脫脂3 h，烘干后加入到pH值為9的超純水中，在57 ℃下提取1 h后，超聲輔助(40 kHz、500 W)提取33 min，抽濾，得到濾液，濃縮后得到酒醅水溶性提取物。向其中加入等體積15%(體積分數)的三氯乙酸，混合靜置1 h，在4 ℃、6 500 r/min條件下離心25 min，沉淀大分子蛋白質，所得上清液即為酒醅肽提取液。

1.4 超濾

在室溫，壓力0.05 MPa條件下，使用1 kDa超濾膜應用Pellicon超濾裝置對酒醅水溶性提取物進行超濾，選取分子質量<1 kDa的組分[25]。使用旋轉蒸發儀在0.09 MPa，50 ℃條件下濃縮，隨后-4 ℃低溫保存備用。

1.5 大孔吸附樹脂對酒醅肽的分級洗脫及除糖

根據ZHANG等[2]的方法選用XAD-16樹脂對多肽提取液進行分級洗脫,并在50 ℃，0.1MPa條件下真空濃縮得到除去糖分的酒醅多肽溶液。

1.6 凝膠過濾層析純化酒醅肽

將Sephadex G-15 凝膠裝入Φ1.6 cm×70 cm層析柱中，加入4 mL樣品，用超純水以0.5 mL/min的速度進行洗脫，用紫外檢測器檢測214 nm下吸光度，按峰收集洗脫液，并將各組分進行冷凍干燥獲得多肽凍干粉。

1.7 半制備高效液相色譜制備酒醅肽

將各個組分樣品凍干粉配制成5 000 mg/L的樣品溶液，經0.45 μm針式過濾器過濾，手動進樣。色譜條件參考前期的研究方法[2]。

1.8 HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定多肽氨基酸序列及含量測定

在HPLC-Q-TOF-MS/MS上對各個純化組分進行序列鑒定。具體色譜條件與ZHANG等[2]的方法一致。采用外標法測定酒醅提取液中多肽濃度，通過合成標準品配制50，100，250，500，1 000，2 000 mg/L的標準品溶液，并通過高效液相色譜建立峰面積-濃度的標準曲線，從而測定樣品中多肽的濃度。高效液相色譜方法參考前期的工作[2]。

1.9 體外抗氧化活性測定

氨基酸殘基位置對多肽抗氧化能力的影響實驗同樣以ABTS、DPPH、ORAC、還原力和亞鐵螯合力5種方法進行測定。合成另外4條與已經鑒定出的多肽氨基酸組成相同，但排列順序不同的多肽，即Gly-Lys-Pro, Gly-Pro-Lys、Val-Asp-Pro、Pro-Asp-Val，對它們采用與上述一致的方法進行抗氧化能力的測定。

1.10 ACE抑制活性的體外評價方法

參考吳繼紅等[23]采用的方法，使用高效液相色譜法測定兩種多肽的ACE抑制活性。

1.11 數據分析

所有測定實驗均重復至少3次，實驗結果以平均值±標準偏差(SD)表示。數據通過IBM SPSS Statistics 19.0進行單因素方差分析，并以Duncans多重比較法進行顯著性差異的分析,不同字母表示不同組別之間存在顯著性差異(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 大孔吸附樹脂XAD-16分離純化酒醅肽

采用對酒醅中多肽吸附效果較好的XAD-16樹脂對樣品進行分離，結果如圖1所示。由圖1可以看到，在體積分數為20%、40%、和60%的乙醇水溶液的解吸過程中，整體出峰情況呈現先增加后減少的趨勢，出峰效果較為明顯。

a-20%乙醇解吸；b-40%乙醇解吸；c-60%乙醇解吸圖1 大孔吸附樹脂XAD-16洗脫圖Fig.1 Macroporous adsorption resin XAD-16 elution diagrams

2.2 凝膠過濾層析分離純化酒醅肽

為進一步分離純化，將已除去糖分的酒醅肽溶液通過凝膠色譜依據分子質量進行分離，最終得出經過體積分數為40%的乙醇水溶液洗脫后的組分分離效果較好，并在其P3組分中分離出A、B、C 3種組分，如圖2所示。

2.3 半制備高效液相色譜分離純化酒醅多肽

使用半制備液相色譜將經過凝膠層析的A、B、C 3個組分進行分離，為了保證每個組分的純度，舍棄分離度較低、雜峰過多的組分。從圖3中可以看出，通過半制備高效液相色譜分離過后，凝膠柱洗脫分離組分A中收集到了A1～A5五個組分，組分B中收集到了B1～B2兩個組分，組分C中收集到了C1、C2兩個組分。

圖2 40%乙醇洗脫組分凝膠層析色譜圖Fig.2 Gel permeation chromatogram of 40% ethanol elution fractions

a-A組分半制備液相圖;b-B組分半制備液相圖;c-C組分半制備液相圖圖3 A、B和C組分半制備液相色譜圖Fig.3 Semi-preparation liquid chromatography diagrams of components A, B and C

2.4 HPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定多肽序列

通過Agilent Masshunter B.06.00電腦工作站對A、B、C 3個組分中的子組分分別進行一級質譜分析，其中發現A4中m/z=330.180 5([M+H+])的組分峰。將m/z=329.180 5的離子作為母離子，進行二級質譜解析。母離子m/z=330.180 5的MS/MS結果如圖4所示。

圖4 VPD MS/MS質譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of VPD

采用從頭測序法解析各個離子的二級質譜碎片信息。肽鍵的酰胺鍵斷裂，C端形成y型離子，N端形成b型離子。分析母離子m/z=329.180 5的二級質譜圖推測m/z=197.090 4的離子碎片為y2離子，可能是Val-Pro;推測m/z=229.112 1的離子碎片為b2離子，可能是Pro-Asp;推測m/z=116.070 2的離子碎片為y1離子，可能是Val；推測m/z=132.115 6的離子碎片為b1離子，可能是Asp。綜上所述，推測m/z=330.180 5的氨基酸序列可能是Val-Pro-Asp。采用同樣的方法發現B1中m/z=300.95([M+H+])的組分峰。將m/z=300.95的離子作為母離子，進行二級質譜解析。母離子m/z=300.95的MS/MS結果如圖5所示。分析母離子m/z=300.95的二級質譜圖推測m/z=114.11的離子碎片為b1離子，可能是Pro;推測m/z=186.29的離子碎片為y2離子，可能是Lys-Gly；推測m/z=242.29的離子碎片為b2離子，可能是Gly-Pro。綜上所述，推測m/z=300.95的氨基酸序列可能是Lys-Gly-Pro。

圖5 KGP MS/MS質譜圖Fig.5 MS/MS spectrum of KGP

與合成的多肽標準品進行比對，從保留時間和質譜結構上并沒有發現明顯區別，因此可以確定，鑒定出的兩種多肽的結構分別為Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro。

2.5 酒醅中KGP和VPD提取含量的計算

對首次從酒醅中鑒定出的兩種多肽KGP和VPD的含量通過高效液相色譜外標法進行了測定，結果如圖6所示，最終測得酒醅提取液中VPD的含量為 569.5 mg/L，而KGP的含量為463.9 mg/L。目前已有研究[23]檢測出白酒中存在多肽Pro-His-Pro(PHP)，但其存在于白酒中的含量極低。酒醅中存在的相對較高含量的多肽可以為后續調整蒸餾條件，提高多肽蒸餾入酒的含量奠定基礎。

2.6 體外抗氧化實驗結果

應用ABTS、DPPH、ORAC、還原力、亞鐵離子螯合能力5種抗氧化能力評價方法對多肽的抗氧化能力進行了測定，Trolox和EDTA-Na2作為標準抗氧化劑，結果如圖7所示。

a-VPD標準曲線;b-KGP標準曲線;c-多肽提取量圖6 KPG和VPD標準曲線及提取量Fig.6 Standard curves and extraction contents of KPG and VPD注：組間不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

a-KGP、GKP、GPK抗氧化能力;b-VPD、VDP、PDV抗氧化能力圖7 多肽的體外抗氧化活性Fig.7 The results of antioxidant activity of peptides in vitro

由圖7可以看出，VPD的ABTS自由基清除能力要強于KGP，這可能與VPD兩端的殘基Val-和Asp-與ABTS作用，從而抑制了ABTS+·的形成有關。在ORAC實驗中VPD的螯合能力同樣略高于KGP。在DPPH實驗中VPD的TE值(0.778 μmol TE/μmol VPD)高于KGP的TE值(0.656 μmol TE/μmol KGP)。兩種多肽的還原力和亞鐵螯合能力實驗中也表現出一定的活性，VPD和KGP的TE值和EE值分別為0.445 μmol TE/μmol VPD，0.369 μmol EE/μmol VPD和0.448 μmol TE/μmol KGP，0.258 μmol EE/μmol KGP。從以上結果可以看出，Val-和Asp-相比于Lys-和Pro-在多肽兩端時能夠表現出更高的ABTS、DPPH自由基清除能力、還原力以及螯合力。

由以上實驗結果可以看出，VPD和KGP兩種多肽在3種濃度下均表現出了一定的體外抗氧化能力。兩種多肽之間存在的抗氧化能力上的差異很可能是由于多肽C端和N端的氨基酸殘基的不同造成的。同種多肽之間的氨基酸排列順序的差異也會對最終的抗氧化能力造成一定的影響。鑒于2種多肽是從酒醅樣品中分離提取鑒定出來的，氨基酸的種類已經決定，因此對多肽中氨基酸排列對多肽抗氧化性造成的影響進行了一定的研究。

實驗結果中測得了具有明顯不同的排列順序的另外2種多肽的抗氧化活性，并與原始多肽的抗氧化能力進行了比較。在KGP多肽中分別選擇了GKP和GPK作為不同氨基酸排列的多肽進行了5種抗氧化能力的測定。其中在ABTS實驗中GKP表現出了最強的抗氧化能力，其TE值為1.384 μmol TE/μmol GKP，同樣GPK也表現出了強于KGP的抗氧化能力，其TE值為1.256 μmol TE/μmol GPK。而在DPPH實驗中,GKP和GPK的抗氧化能力分別為0.457和0.531 μmol TE/μmol GPK，兩者都低于KGP，因此Lys-在C端和Pro-在N端能夠起到強DPPH自由基清除能力。在ORAC實驗中所表現出的實驗結果與ABTS中基本一致，GKP具有最高的TE值1.236 μmol TE/μmol GKP，GPK略低，TE值為1.115 μmol TE/μmol GPK。在還原力實驗中GKP具有最高的TE值為0.665 μmol TE/μmol GKP，而GPK的還原力TE值最弱為0.236 μmol TE/μmol GPK。在亞鐵螯合能力實驗中GPK表現出了相對較強的能力，其EE值為0.334 μmol EE/μmol GPK，而GKP的亞鐵螯合能力最低EE值為0.158 μmol EE/μmol GPK。在VPD多肽中分別選擇了VDP和PDV作為不同氨基酸排列的多肽進行了5種抗氧化能力的測定。不同于KGP，在VPD的實驗中，3種多肽并沒有表現出明顯的差異性，僅在DPPH實驗中表現出了最為明顯的區別，其中VDP表現出了3種多肽中最強的能力，其TE值為0.961 μmol TE/μmol VDP，PDV次之，其TE值為0.884 μmol TE/μmol PDV，兩者都高于酒醅中已鑒定出的多肽VPD。在亞鐵螯合能力測定實驗中,VDP表現出了略強于其他兩種多肽的抗氧化能力，其EE值為0.387 μmol EE/μmol VDP，其他兩種多肽的抗氧化能力并沒有顯著性的差異。

通過對以上的結果進行分析可以得出，多肽之間不同的氨基酸排列順序對于多肽的抗氧化能力有著一定程度的影響。在KGP結構關系實驗中，以GKP為基準對比其他兩種多肽，GKP在AAPH實驗中表現出了最強的抗氧化能力，由此可以推斷Pro-在N端和Gly-在C端所表現出的ABTS自由基清除能力要更強一些。在DPPH實驗中酒醅肽KGP具有最強的抗氧化能力，由此推斷Lys-在N和C端都可以表現出較強的DPPH自由基清除能力。在ORAC實驗中可以看出GKP具有最強的抗氧化能力，對比3種多肽結構可以推斷出Gly-在C端和Pro-在N端具有較高的抗氧化能力。在還原力實驗中可以推斷出Gly-在C端對還原力具有一定的促進作用。在亞鐵螯合力實驗中可以看出，Lys-在C端和N端都具有較強的抗氧化能力。在VPD的結構關系實驗中，3種多肽只有在DPPH和亞鐵螯合能力實驗中表現出了一定的差異，通過比較可以得出，Pro-在多肽的兩端是能夠表現出較強的DPPH自由基清除能力。在亞鐵螯合能力實驗中同樣可以推斷出Pro-在N端時能夠體現出相對較強的抗氧化能力。以上研究為后續依據氨基酸的種類和排列順序初步確定酒醅中多肽的抗氧化能力提供了參考。

2.7 ACE半抑制濃度測定

用 0.1 mol/L pH 8.3 的硼酸-硼砂緩沖液配制40、20、10、5及2.5 mmol/L的Lys-Gly-Pro和Val-Pro-Asp標準品溶液來測定其對ACE酶的半抑制濃度IC50。以lg(ACEI)對lg[R/(1-R)]作圖，如圖8所示，得到KGP的方程y=0.164 5x-0.176 5，當Y=0時X為1.07，IC50為2.91 mmol/L；VPD的方程y=0.178 9x-0.134 2，當Y=0時，X為0.75，IC50為2.11 mmol/L。因此兩種多肽具有一定的ACE抑制活性。

a-KGP的ACE抑制活性標準曲線;b-VPD的ACE抑制活性標準曲線圖8 KGP和VPD的ACE抑制活性標準曲線Fig.8 ACE inhibitory activity standard curves of KGP and VPD

多肽的ACE抑制活性的強弱與組成多肽片段的氨基酸的種類、疏水性以及其在肽鏈中的位置都密切相關。CHEUNG等[29]認為，ACE抑制肽的活性主要取決于C端的氨基酸種類，若C端氨基酸為芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)和脯氨酸時，其抑制活性較高。此外，N端為疏水性的纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或堿性氨基酸，與ACE的親和力較強，因此抑制活性也較高。而高親水性氨基酸由于親水性使其無法接近ACE活性部位，從而導致氨基酸的抑制活性較弱或無抑制活性[30]。本研究中VPD和KGP肽段具有一定的ACE抑制活性，推測可能與其結構中C端存在的脯氨酸、天冬氨酸和N端存在的疏水性纈氨酸、賴氨酸有關。

3 結論

本文以濃香型白酒古井貢酒酒醅為研究對象，通過超濾、大孔吸附樹脂、凝膠層析和反向高效液相色譜法等方法對酒醅水溶性提取物進行多步分離制備，從而獲得高純度肽。實驗通過HPLC-Q-TOF-MS/MS首次鑒定出兩種肽，其氨基酸序列分別為Val-Pro-Asp和Lys-Gly-Pro，并發現2種多肽具有一定的抗氧化能力和ACE抑制能力，以及不同種類的氨基酸處于C端和N端時對抗氧化能力有一定的影響。研究發現酒醅中存在具有生物活性的小分子肽，這將為白酒企業后續改進蒸餾方式從而增加白酒中多肽含量提供理論基礎。

在未來的實驗中，需要研究KGP和VPD兩種多肽中的每一種氨基酸分別在C端和N端時對抗氧化能力的影響，以及這2種多肽的細胞水平和動物水平的抗氧化和降血壓實驗，同時酒醅中存在的其他尚未確定結構及活性的多肽仍有待研究。