賴氨酸芽孢桿菌He14發酵產物抗真菌活性的初步研究

鄭雯，楊興變，康冀川，李洪慶,3*

1(貴州大學 藥學院，貴州 貴陽，550025) 2(貴州大學,西南特色藥用生物資源開發利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽，550025) 3(貴州民族大學 化學工程學院，貴州 貴陽，550025)

賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)廣泛存在于海洋、土壤、植物體內及動物體內，該菌的發酵產物在各個領域中均有應用潛力。有報道表明，賴氨酸芽孢桿菌可對食物和農產品的黃曲霉毒素B1進行降解[1]；劉貴友等[2]從土壤樣品中分離得到1株耐有機溶劑的賴氨酸芽孢桿菌CGMCC 4913，該菌能將葛根素轉化成葛根素-7-O-果糖苷；AHMAD等[3-4]從果蔬中分離得到賴氨酸芽孢桿菌JX416855、JX416856，2株菌具有抗食源性細菌的潛力；SEO等[5]從賴氨酸芽孢桿菌中分離得到一種可轉化蓖麻油酸的化合物10,12-dihydroxystearic acid，通過乳化活性實驗表明該化合物可用作生物表面活性劑。

芽孢桿菌在發酵過程中能產生脂肽類、聚酮類、有機酸類、細菌素等[6-9]抗菌物質，在食品保鮮、環境治理、植物病害防治和醫藥治療上具有極大的應用價值。目前對賴氨酸芽孢桿菌發酵液抗真菌活性的研究較少，有文獻報道賴氨酸芽孢桿菌B-CM18對植物病原真菌的生長有抑制作用[10]，還沒有抗動物病原真菌方面的報道。

本研究對賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)He14發酵液的抗真菌譜進行初步研究，對發酵液中活性成分進行了穩定性考察及抑菌活性物質富集方式的優化，初步純化富集得到的活性粗產物，研究結果為賴氨酸芽孢桿菌的開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

賴氨酸芽孢桿菌(Lysinibacillusfusiformis)He14、水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)、煙草黑脛病菌(Phytophthoranicotianae)、辣椒灰霉病菌(Botrytiscinerea)、馬鈴薯早疫病菌(Alternariasolani)、馬鈴薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)、須毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes)、紅色毛癬菌(Trichophytonmbmm)：均由貴州大學貴州省生化工程中心分離保藏。

1.1.2 培養基

NB固體培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。

NB液體培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，121 ℃滅菌30 min。

PDA培養基(g/L)：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂20，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器與設備

SFAT-8000C液體發酵自動控制系統，江蘇大學鎮江市江大科技有限公司；SA-1480-2水平層流潔凈工作臺，上海上凈凈化設備有限公司；PQX多段可編程人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司；SORVALL Legend MICRO 21微量離心機，賽默飛世爾科技有限公司；R-100旋轉蒸發儀，瑞士BUCHI公司；PHS-25 pH測試儀，上海雷磁儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原真菌的活化

將6株植物病原真菌和2株動物病原真菌接種于9 cm的PDA培養皿中，28 ℃培養，待菌絲體長滿培養皿后，4 ℃保存備用。

1.2.2 菌株He14發酵液的制備

將菌株He14接種于NB固體培養基中，28 ℃活化培養24 h。制備NB液體培養基，于121 ℃滅菌30 min后接種活化好的菌株，作為種子液于28 ℃、120 r/min搖床培養24 h。將He14種子液以1%的接種量接種于裝有NB液體培養基的10 L發酵罐中，作為發酵液于28 ℃、120 r/min培養3 d。

1.2.3 菌株He14發酵液對不同病原真菌的抑制作用

取少量菌株He14的發酵液，經4 200 r/min離心10 min后，上清液用細菌過濾器過濾，濾液采用生長速率法[11]進行活性測定。即將發酵濾液和PDA培養基混合倒入培養皿中，制成含藥培養基，發酵液的質量濃度為3 g/L，等量無菌水為空白對照。用5 mm打孔器對培養好的病原真菌自菌落邊緣切取菌餅，將菌餅放置于培養皿中央，菌絲面朝上，于培養箱中培養至各病原真菌的空白對照菌絲長滿培養皿。通過十字交叉法測定菌落直徑，按公式(1)計算發酵濾液對各病原真菌菌絲生長的抑制率。

(1)

1.2.4 發酵液抗真菌成分的穩定性

在不同溫度(0、20、40、60、80、100 ℃)處理發酵液 1 h 后測定抑真菌活性效果；用10%(體積分數)HCl和100 g/L NaOH調節發酵液pH值(1、3、5、7、9、11、13) 2 h后再調回到初始pH值7.85，測定抑真菌活性效果；將發

酵液置于30 W紫外燈下照射30、60、90、120、150、180 min，以未經紫外照射的發酵液做為對照測定抑真菌活性效果。指示病原真菌為辣椒灰霉病菌。

1.2.5 不同方法富集發酵液的抑菌活性成分

將發酵液分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按1∶1(體積比)萃取2次，合并相同的有機層及水層，濃縮至干測定抑真菌活性；使用明礬、AlCl3、FeSO4、Al2(SO4)3處理發酵液后取上清液及沉淀物測定抑真菌活性；選用非極性大孔吸附樹脂D101、LX-60，中等極性大孔吸附樹脂LSA-12、XDA-6，極性大孔吸附樹脂LX-17、XDA-8G對發酵液進行吸附，用乙醇進行洗脫，將流出液與洗脫液分別濃縮至干，得粗產物，測定其抑真菌活性。指示病原真菌為辣椒灰霉病菌。

1.2.6 活性粗產物的純化與活性篩選

將經過富集處理的活性粗產物用硅膠柱層析，通過瓊脂擴散法[12]對初步分離得到的產物進行抑真菌實驗，供試病原真菌為水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌、馬鈴薯早疫病菌和須毛癬菌。

1.2.7 數據處理

數據均為3次獨立試驗平均值，采用Microsoft Excel 2007對原始試驗數據進行整理，用SPSS 17.0進行統計分析，所得實驗數據采用方差分析(ANOVA)，并用Duncan法對各測定數據進行顯著性檢驗，結果以均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 菌株He14發酵液對不同病原真菌的抑菌能力

試驗結果表明，菌株He14的發酵液對6株植物病原真菌和2株動物病原真菌的生長均有抑制作用(表1，圖1)。在植物病原真菌中，發酵液對馬鈴薯晚疫病菌的拮抗作用最強，抑制率為100%；對辣椒疫霉菌的拮抗作用相對較弱，抑制率為81%；對水稻紋枯病菌、水稻稻瘟病菌、煙草黑脛病菌和馬鈴薯早疫病菌的抑制率在50%～75%。對動物病原真菌須毛癬菌和紅色毛癬菌的拮抗強度相同，抑制率均為75%。綜合抑制率與病原真菌的生長速度考慮，選擇辣椒灰霉病菌作為菌株He14抗真菌活性實驗的指示菌用于后續實驗。

表1 菌株He14對病原真菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of strain He14 on pathogenic fungi

注：A-水稻稻瘟病菌；B-煙草黑脛病菌；C-馬鈴薯早疫病菌；D-須毛癬菌；E-水稻紋枯病菌；F-紅色毛癬菌；G-辣椒灰霉病菌；H-馬鈴薯晚疫病菌。下同。

2.2 菌株He14發酵產物抑真菌活性物質的穩定性

實驗表明，菌株He14的發酵液在低溫及中高溫環境抑制率為76%～79%，在120 ℃下處理1 h后抑制率為71%，說明發酵液中活性成分具有一定的熱穩定性；發酵液在pH 3～11環境下處理2 h后對供試病原真菌的抑制率可維持在70%～81%，在pH 1和pH 13時抑制率下降，為53%～59%；發酵液在紫外環境下處理30 ～180 min后抑制率維持在78%左右，與未經紫外照射的對照組相比抑制率基本不變，說明菌株He14發酵液中的抑菌活性物質具有紫外穩定性(圖1～圖3)。

圖1 溫度對菌株He14發酵液抑菌活性的影響Fig.1 Effect of temperature on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

2.3 不同富集方法對發酵液抑真菌活性成分的影響

試驗結果表明，發酵液經萃取處理后，各有機層粗提物與各水層粗提物均有不同程度的抑真菌效果，同等濃度下各有機層與各水層的抑真菌效果均小于原液，且活性規律不明顯；AlCl3、FeSO4、Al2(SO4)3

圖2 pH值對菌株He14發酵液抑菌活性的影響Fig.2 Effect of pH on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

圖3 紫外對菌株He14發酵液抑菌活性的影響Fig.3 Effect of UV on antibacterial activity of strain He14 fermentation broth

均不能使發酵液變澄清，發酵液經明礬處理后液體雖然可以澄清，但活性較原液大大降低，且沉淀物沒有抑真菌活性；大孔吸附樹脂可有效富集發酵液中的活性成分，其中LX-60型大孔吸附樹脂效果最好(表2～表5)。

表2 萃取實驗結果Table 2 Results of extraction

注：“-”表示未檢出。下同。

表3 發酵液加入絮凝劑后活性變化結果Table 3 Results on treatment by flocculant

表4 大孔吸附樹脂流出液抑真菌活性Table 4 Antifungal activities of effluent of resins

表5 大孔吸附樹脂洗脫液抑真菌活性Table 5 Antifungal activities of eluent of resins

2.4 抑真菌活性產物的篩選

活性粗產物經硅膠柱層析后得到不同的混合組分。抑真菌活性實驗結果表明混合組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ顯示出了抑真菌活性(表6)。其中組分Ⅱ對供試病原真菌的生長均有抑制效果，組分Ⅰ對水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌有抑制作用，組分Ⅲ對馬鈴薯晚疫病菌、辣椒灰霉病菌和須毛癬菌有抑制作用。

另外，病原真菌給藥處理持續培養時發現，組分Ⅱ不僅對馬鈴薯晚疫病菌的生長有較強的抑制作用，還可令已生長的馬鈴薯晚疫病菌菌絲死亡(圖4)。

表6 混合組分Ⅰ, Ⅱ和Ⅲ對病原真菌的抗菌譜Table 6 Antifungal spectrum of compoundⅠ，Ⅱ and Ⅲ against pathogenic fungi

注：-表示無抑菌活性；+表示弱抑菌活性；++表示中等抑菌活性；+++表示強抑菌活性；I-水稻紋枯病菌。

A-培養7 d；B-培養10 d圖4 混合組分對馬鈴薯晚疫病菌抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of components onPhytophthora infestans注：a為組分Ⅰ; c為組分Ⅱ; b與d為空白對照組。

3 討論

目前對賴氨酸芽孢桿菌的研究表明，其產生的活性物質主要有蛋白酶類[13]、多糖類[14]、表面活性劑[15-16]等。曾承露等[17]運用響應面法對賴氨酸芽孢桿菌P-3產胞外多糖的發酵工藝參數進行了優化，使該菌產生胞外多糖的平均產量提高到2.92 g/L。王偉高等[18-20]從小鼠體內分離得到1株可產氨基甲酸乙酯水解酶的賴氨酸芽孢桿SC02，經發酵培養條件優化后，該菌株最高酶活水平可達到7 066 U/L。PARK等[16]從賴氨酸芽孢桿菌KMC003中分離出螺環戊烯酮、螺菌毒素，但未進行活性測定。SINGH等[10]對賴氨酸芽孢桿菌B-CM18進行廣譜抗菌測定，發現該菌株對多種植物病原真菌有拮抗性并分離到了抗菌活性物質——幾丁質酶，但并未加入動物病原真菌。

本研究不僅測定了常見的植物病原真菌，還測定了對人類有感染性的動物病原真菌，豐富了賴氨酸芽孢桿菌的抗真菌譜。研究發現該菌株的活性物質具有良好的穩定性，為后期分離純化工作奠定了基礎。以抑真菌活性結果為指導，相比較于萃取和沉淀處理發酵液，使用大孔吸附樹脂能有效富集He14發酵液的抗真菌活性物質。對活性粗產物進行初步分離，得到有抑真菌活性的混合組分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，其中組分Ⅱ抑真菌效果最強，且可令已生長的馬鈴薯晚疫病菌菌絲死亡，說明該組分可深入研究其抑真菌機制，以期發揮其在生物防治方面的潛力。